硝化细菌包埋固定化条件的研究

南晓梅，宋新山，赵晓祥

(东华大学 环境科学与工程学院，上海 201620)

目前，随着水体富营养化现象的日趋严重，废水生物脱氮技术作为一种高效、环保的污水处理技术，逐渐成为水处理领域关注的焦点，硝化细菌是被广泛应用于水体除氮的菌种［1］。微生物固定化技术经过特定的技术方法将细菌细胞固定化在所选择的载体上，优点是能够防止发生菌体流失现象，并提高细菌的可利用率，从而达到简化处理工艺，提高应用效率的目的［2］。包埋法是将微生物菌株包埋在半透性的聚合物凝胶或膜内，或使微生物细胞分散进入多孔性的载体内部，包埋法固定微生物是一种当前被普遍应用的固定化方法［3-4］。

本实验采用聚乙二醇和海藻酸钠为载体，对Y1菌株进行包埋固定化实验，以Y1 菌株降解氨氮的效率为实验指标进行降解正交实验，研究各种包埋固定化条件因素对固定化小球降解效率的影响。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

硝化细菌Y1 菌株，从污水处理厂的活性污泥中分离;聚乙二醇(PEG)，生化试剂;海藻酸钠(SA)，化学纯;氯化钙，分析纯;氨氮废水，采用人工配水，成分［5-6］为:蔗糖223 mg/L，NH4Cl 191 mg/L，NaHCO3500 mg/L，MgSO412. 5 mg/L，KH2PO420 mg/L，FeSO45 mg/L，CaCl25 mg/L，微量元素1.0 mL/L。微量元素为:H3BO3150 mg/L，ZnCl250 mg/L，CuCl220 mg/L，MnSO4·H2O 50 mg/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 60 mg/L，CoCl2·6H2O 150 mg/L，FeCl350 mg/L 和NiCl240 mg/L。

1.2 固定化颗粒制备

1.2.1 菌悬液的制备 将恒温培养24 h 的细菌培养液装入离心管，以8 000 r/min 的速度离心10 ～20 min，弃去上清液，用无菌生理盐水洗涤后，再反复离心3 ～4 次，最后用去离子水稀释，制成菌悬液。

1.2.2 固定化载体的处理 分别取一定克数的PEG 和SA，加入锥形瓶中，并加入100 mL 去离子水，121 ℃灭菌20 min，使其完全混合。

1.2.3 交联剂的制备 取一定克数CaCl2，加入到100 mL 去离子水中，完全溶解后高温灭菌备用。

1.2.4 固定化小球的制备 将菌悬液倒入冷却后的PEG 和SA 载体混合液中，搅拌使其混合均匀。用注射器将混合液注入到CaCl2交联剂溶液中，冰浴，边滴边搅拌，使滴入液形成2 ～3 mm 的小球，4 ℃交联后用去离子水洗涤，得到固定化颗粒。

1.3 分析方法

各种指标的测试方法如下:pH 值，玻璃电极法;氨氮，采用气相分子吸收光谱法进行测定。

2 结果与讨论

2.1 固定化颗粒的外部形态

细菌固定化小球形态见图1。

图1 PEG 和SA 的固定化微球Fig.1 Picture of immobilized microspheres of PEG and SA

由图1 可知，PEG 和SA 包埋的固定化小球成型状况良好，粒径大小均匀，直径3 ～4 mm，为白色半透明状。

2.2 聚乙二醇浓度对固定化小球成球效果的影响

聚乙二醇浓度为1.0% ～8.0%，海藻酸钠浓度为3.0%，菌悬液添加量为50%，CaCl2交联剂浓度为4%，交联时间5 h，成球情况见表1。

表1 聚乙二醇对固定化的影响Table 1 Effect of PEG on immobilization

成球状态较好的固定化小球应该具有较好的传质性能和机械强度［7］。机械强度越大，说明固定化小球越坚固，可在降解中重复使用。渗透时间越小，说明固定化小球所包埋的内部细菌越容易与外部污染物进行反应，对外部污染物进行降解。由表1 可知，PEG 浓度小于3.0%时，固定化小球会不易形成或出现拖尾现象;PEG 浓度为4.0%以上时，小球的机械强度会开始增大，到PEG 浓度为8.0%时，达到62.01 g 的最大值。小球的破碎率在PEG 为8.0%时降为0。综合以上各方面因素，本实验的PEG 浓度范围选定为4.0%，6.0%和8.0%。

2.3 海藻酸钠浓度对固定化小球成球效果的影响

选择浓度1.0% ～7.0%的海藻酸钠和5.0%的聚乙二醇混合溶液作为复合载体包埋剂，菌液添加量为50%，交联剂为4% 的CaCl2溶液，交联时间5 h，成球情况见表2。

表2 海藻酸钠对固定化的影响Table 2 Effect of SA on immobilization

由表2 可知，随着SA 浓度的增加，小球的机械强度随之增加，相反，渗透性随之降低，从5.0%浓度开始其渗透性有明显下降，15 min 内固定化小球才能够被完全渗透。总结以上结果，海藻酸钠的浓度范围选择为2.0% ～4.0%。

2.4 交联剂浓度对固定化小球成球效果的影响

聚乙二醇浓度6%，海藻酸钠3%，菌悬液添加量为50%，交联时间5 h，交联剂浓度为1% ～6%，分别测定小球的机械强度、渗透性以及破碎率，结果见表3。

表3 交联剂对固定化的影响Table 3 Effect of cross-linking on immobilization

由表3 可知，随着交联剂浓度的增加，小球的机械强度、渗透时间随之增加，但是增加程度不是很大，这说明交联剂浓度对固定化小球的性能影响相对于其他因素较小。综合以上结果，交联剂浓度范围确定为4.0% ～6.0%。

2.5 交联时间对固定化小球成球效果的影响

聚乙二醇浓度为6%，海藻酸钠为3%，菌悬液添加量为50%，每隔5 h 取出小球测定机械强度、渗透性及破碎率，结果见表4。

表4 交联时间对固定化效果影响Table 4 Effect of cross-linking time on immobilization result

由表4 可知，随着交联时间的增加，小球内部包埋材料逐渐形成稳定的框架结构，固定化小球的机械强度逐渐增大，破碎率从开始的31.67%最终降低至0，而渗透时间也会随着交联时间的增加而增加。当交联时间为15 h 以下时，固定化小球的机械强度很小，破碎率比较高;交联时间在35 h 和40 h时，虽然破碎率降至0，但是小球的渗透性能较差。确定交联时间为15 ～25 h 进行正交实验。

2.6 正交实验

以初始氨氮浓度为10 mg/L 的氨氮降解率为实验指标，对聚乙二醇浓度、海藻酸钠浓度、交联剂的浓度和交联时间进行正交实验，研究固定化细菌的最佳包埋条件。各因素水平见表5，结果见表6。

表5 因素水平Table 5 Factors and levels

表6 正交实验结果Table 6 Results of orthogonal experiment

由表6 可知，4 个因素的最优水平是A3B2C1D2，即聚乙二醇浓度8%，海藻酸钠浓度3%，交联剂浓度4%，交联时间为20 h。4 因素影响的主次顺序是A ＞B ＞C ＞D，即聚乙二醇浓度的影响最大，然后是海藻酸钠浓度，而CaCl2浓度和交联时间对固定化小球的成球效果影响最小。实验结果的方差分析见表7。

表7 固定化小球正交实验方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal experiment

由表7 可知，4 种因素的F 值全部小于Fa的值，即4 种因素对固定化小球降解效率不会产生显著影响。

3 结论

以固定化菌株氨氮降解率为指标进行正交实验，结果显示，聚乙二醇浓度8%，海藻酸钠浓度3%，CaCl2浓度4%，交联时间20 h 为最佳固定化条件。其中，聚乙二醇浓度的影响最大，然后是海藻酸钠浓度，而CaCl2浓度和交联时间对固定化小球的成球效果影响最小。4 种因素对固定化小球降解效率的影响均不显著。

［1］ 任海波.养殖废水氨氮降解菌的分离、鉴定与固定化研究［D］.青岛:中国海洋大学，2004.

［2］ 申婷婷，李小明，岳秀，等. 微生物固定化技术的研究与应用［J］.广州化工，2011，39(20):3-5.

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［4］ Seo Jaekoan，JungⅡhyong，Kim Miryung，et al. Nitrification performance of nitrifiers immobilized in PVA for a marine recirculating Aquarium system［J］. Aquacultural Engineering，2001，24(3):181-194.

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［6］ 魏俊虎. 脱氮除磷菌的驯化分离及其性能优化研究［D］.上海:东华大学，2011.

［7］ 魏宏斌，陈世和. 废水生物处理中固定化技术的研究与应用［J］.江苏环境科技，1996，9(2):10-14，22.