酶法合成阿托伐他汀侧链中间体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的研究进展

叶晶晶，董思川，柳志强，郑裕国

（浙江工业大学 生物工程研究所，浙江 杭州 310014)

1 引言

他汀类药物是上世纪80年代末开发的一类降血脂药物，目前已发展到第三代，即全合成他汀，主要有氟伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀等。其中，美国Pfizer公司开发的阿托伐他汀(商品名利普妥，Lipitor)是第一个年销售额超过100亿美元的重磅药物，自2000年起，便蝉联全球畅销药销售榜首12年，为Pfizer公司赚取约1300亿美元的收入，其结构如图1所示。

图1 阿托伐他汀

2011年，阿托伐他汀专利到期，对其合成工艺的改进尤其是手性侧链制备新工艺的开发再次引起各界关注。传统的全化学合成工艺存在部分反应条件苛刻，环境污染严重等问题，因此近年来利用生物酶法合成阿托伐他汀侧链中间体逐渐成为研究热点。本文着重介绍近年来酶法合成在阿托伐他汀侧链中间体 (S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(Ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate, (S)-CHBE)中的应用。

2 酶法合成在 (S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用

(S)-CHBE通过对C4上氯进行取代得到(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(Ethyl(R)-4-cyano-3-hydroxybutanoate,HN)，因此是阿托伐他汀手性侧链合成的关键手性中间体。此外，(S)-CHBE还可用于合成海洋溴吡咯生物碱Slagenins B和C、1,4-二氢吡啶类β-阻滞剂及抗艾滋药物重要中间体(S)-3-羟基四氢呋喃等。(S)-CHBE的化学合成以 (S)-环氧氯丙烷为底物在0℃加入氰化钠开环得到(S)-4-氯-3-羟基丁腈，再经过乙醇醇解合成(S)-CHBE。或者以4-氯乙酰乙酸乙酯 (Ethyl 4-chloroacetoacetate,COBE)为底物，利用手性钌催化剂对羰基进行不对称加氢还原生成(S)-CHBE。前者反应需在低温条件下进行，能耗巨大，且使用有毒有害试剂；而后者催化剂不易获得，对生产设备要求高。随着生物催化转化技术的发展，其反应条件温和，立体选择性高，成本相对低廉，且环境友好的优势日益突出，逐渐受到人们关注。因此，利用酶法合成(S)-CHBE成为研究热点。

(S)-CHBE的酶法合成主要分为两种，即外消旋体手性拆分及不对称还原。外消旋体手性拆分是指通过脂肪酶或者微生物细胞将CHBE外消旋体分离成单一的对映异构体。不对称还原是指利用羰基还原酶对COBE上羰基进行不对称加氢合成(S)-CHBE。

2.1 脂肪酶等在(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成中的应用

黄泱等[1]利用CHBE与乙酸乙烯酯在脂肪酶催化下发生转酯化反应生成4-氯-3-乙酰氧基丁酸乙酯(CABE)和乙醛，可以得到e.e.值达到50%的(R)-CHBE。 Hoff等[2]以 Rhizomucor miehie脂肪酶作为催化剂，在苯中催化CHBE与丙酸乙烯酯进行不对称转酯化反应，所得产物e.e.值可达到87%左右。以上两个例子属于典型的酶促手性拆分手段，经过相应处理后，均可获得两个对映体纯的CHBE。

另外，也可以利用微生物细胞对CHBE进行不对称转化。Suzuki等[3]利用两种Pseudomonas sp静息细胞对外消旋CHBE进行动力学脱卤，Pseudomonas sp OS-K-29可将(R)-对映体转化为相应二醇，所得 (S)-CHBE产率 33%，e.e.＞98%；而Pseudomonas sp DS-K-NR818可将 (S)-对映体转化为(S)-3-羟基-γ-丁内酯，所得(R)-CHBE产率40%，e.e.＞98%。

利用外消旋体拆分法制备手性CHBE的理论收率仅50%，且产物为混合物，不易分离，与潜手性羰基化合物不对称还原制备手性醇相比处于劣势。因此，研究者更关注CHBE的生物不对称合成方法。

2.2 羰基还原酶在(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成中的应用

酶法不对称还原合成 (S)-CHBE的催化剂羰基还原酶(Carbonyl reductase，EC 1.1.1.184)属于短链脱氢/还原酶(Short-chain dehydrogenases/reductases，SDR)超家族，多为NADPH辅酶依赖型的单亚基胞内酶，广泛存在于各种微生物中。羰基还原酶可将潜手性酮类化合物不对称还原为手性醇，常被用于手性药物中间体或精细化工产品的合成。利用羰基还原酶将COBE不对称还原合成(S)-CHBE的过程需要NAD(P)H参与，而微生物细胞通常具备完整的辅酶再生系统，可以通过添加辅助底物实现辅酶再生，其原理如图2所示。

目前，国内外研究者已经从多种微生物中发现了产(S)-CHBE的羰基还原酶，并对其进行了研究。早在1990年，Shimizu等[4]便筛选到一株Trichosporon cutaneum AKU 4864，以其作为催化剂将30 mM COBE还原为(S)-CHBE，最终(S)-CHBE摩尔产率为85%，e.e.值达到91%，而之前的报道多为利用微生物进行 (R)-CHBE的生产。随后，Patel等[5]利用 Geotrichum candidum SC 5469将10 g/L COBE不对称还原为 (S)-CHBE，产率为95%，e.e.值96%，通过将细胞置于55℃热处理30 min可将产物e.e.值提高至99%。2010年，Kaliaperumal等[6]将 Candida parapsilosis ATCC 7330 用于(S)-CHBE的合成，采用底物分批补料的方式，同时在90 min加入新鲜细胞，反应12 h后 (S)-CHBE浓度达到1.38 M(230 g/L)，产率为95%，e.e.值大于99%。随后，乐庸堂[7]以Candida parapsilosis CCTCC M 203011全细胞进行催化，通过产物外回路移除反应器解除产物对细胞的抑制作用。将底物COBE和辅助底物葡萄糖以等摩尔比配成4 g/L溶液进行流加，同时根据反应速率对流加速率进行调整，流出液中产物用树脂进行吸附。最终，(S)-CHBE浓度可达到308 g/L，产率达到97.2%，较两相体系(230 g/L)提高33.9%。同时这也是目前报道利用野生型菌株催化合成 (S)-CHBE的最高浓度。另外，研究者们也从Cylindrocarpon sclerotigenum，Aureobasidium pullulans，Saccharomyces cerevisiae等微生物中筛选到可以还原(S)-CHBE的野生型菌株。表1列举了部分用于合成(S)-CHBE的羰基还原酶。

图2 羰基还原酶催化COBE合成(S)-CHBE

生物法不对称还原生产(S)-CHBE优势显著，与化学法相比具有反应条件温和、立体选择性高、设备投入低、绿色环保等优势；与手性拆分法相比，克服了单个对应异构体最高收率50%及产物分离困难的缺陷。然而从自然界筛选到的微生物对底物及产物的耐受力不高，胞内存在的众多酶系导致产率及对映体选择性下降，而基因工程技术的普及，在改善微生物催化性能上发挥了重要作用。

3 酶法合成 (S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯辅酶再生系统的构建

为了提高反应催化效率，减少细胞内其它酶系对产物产率及对映体选择性的影响，通常利用基因工程手段将羰基还原酶进行克隆表达，同时构建辅酶再生系统。

目前，用于不对称还原反应的辅酶再生系统有两种：双酶耦联型辅酶再生系统及底物耦联型辅酶再生系统。其中，双酶耦联系统通过两种酶催化不同的氧化还原反应完成辅酶循环，是常用的氧化还原催化体系，可将甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶与羰基还原酶进行耦联构建辅酶再生系统。而底物耦联系统则是通过同一种酶催化不同的氧化还原反应完成辅酶循环，由于需要酶同时具备氧化及还原能力，且底物与辅助底物必须与不同的活性中心结合，因此报道较少。

3.1 双酶耦联型辅酶再生系统

Kizaki等[18]将Candida magnoliae来源的羰基还原酶S1与Bacillus megaterium来源的葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中进行共表达，并将其用于(S)-CHBE的不对称合成。采用分批补加底物的策略进行反应，水相体系中(S)-CHBE的浓度达到208 g/L。当使用两相体系时，(S)-CHBE在有机相的浓度可达430 g/L，其摩尔转化率为85%，产物e.e.＞99%。后来，又有学者做了S1辅酶依赖型的研究，使其可以利用NADH进行辅酶循环，最终得到 163 g/L(S)-CHBE，e.e.＞99%。 Yamamoto[11]等将K.aestuarii来源的羰基还原酶KaCR1与葡萄糖脱氢酶及甲酸脱氢酶分别在大肠杆菌中进行共表达，比较两种双酶耦联体系 (S)-CHBE的生产能力，最终，KaCR1/甲酸脱氢酶共表达体系的产量为19.0 g/L，而共表达葡萄糖脱氢酶的产量达到45.6 g/L。虽然以甲酸脱氢酶进行辅酶再生的效率低于葡萄糖脱氢酶，但是甲酸廉价易得，其产物CO2不会对羰基还原酶活力造成抑制，同时容易从体系中除去，因而具有一定的应用前景。另外，也有学者利用毕赤酵母作为宿主生产(S)-CHBE，但仅能转化350 mM底物。An等[17]利用基因组数据挖掘方法从C.albicans中获得羰基还原酶CaCR，并与葡萄糖脱氢酶在E.coli Rosetta(DE3)中进行共表达，经过优化后，24 g DCW/L细胞经过25 h可将4.8 M COBE完全转化，摩尔产率93.8%，e.e.＞99%，同时不需要额外添加辅酶，这是报道产量最高的双酶耦联型辅酶再生系统，具有很好的工业应用价值。

3.2 底物耦联型辅酶再生系统

2006 年，Inoue等[19]将从 Leifsonia sp.S749 中得到的醇脱氢酶LSADH用于 (S)-CHBE的合成。LSADH为NADH辅酶依赖型，可以将多种潜手性酮及酮酸酯还原成相应的R型醇，并且可以利用异丙醇、2-丁醇、环戊醇等烷基醇实现自身辅酶循环。当以异丙醇进行NADH原位再生时，(S)-CHBE的积累浓度超过350 g/L，且e.e.＞99%。

2011年，Wang等[14]利用基因组挖掘技术从S.coelicolor中克隆到一种NADH依赖型的羰基还原酶ScCR，分子量约为26 kDa。ScCR具有广泛的底物谱，能够催化多种潜手性芳基酮、α-及β-酮酯，其中对于β-酮酯具有很高的立体选择性，e.e.＞99%。该酶在催化COBE还原的同时，还可以催化异丙醇的氧化，从而实现辅酶再生。在甲苯/水两相体系中，ScCR可以完全催化600 g/L(3.6 M)COBE生成(S)-CHBE，产率达到93%，e.e.＞99%。这也是目前文献报道中底物耦联型辅酶再生系统最高的底物浓度，具有不错的工业化前景。

Cai等[20]从C.albicans中筛选到的一种NADPH依赖的山梨糖还原酶SOU1，属于SDR超家族，其最适pH为6.2，温度为30℃。SOU1具有山梨醇脱氢酶活性，可以将山梨醇、甘露醇及木糖醇氧化成相应的糖，同时，SOU1可以将COBE不对称还原成(S)-CHBE，e.e.值达到99.6%。当山梨醇：COBE为2:1时，在不额外添加辅酶的条件下可将2.5 M的COBE还原生成2.34 M(S)-CHBE，相较于双酶耦联系统，底物耦联系统不需要调节pH，简化了生产工艺。

4 总结与展望

统计显示，他汀类药物在降血脂药物市场中所占份额达到90%以上，而阿托伐他汀控制了两成的他汀类药物市场份额。与此同时，阿托伐他汀在国内需求也呈现持续上涨趋势，未来市场前景广阔。另外，阿托伐他汀专利的到期也为市场发展注入强劲动力。当前，利用羰基还原酶进行阿托伐他汀手性侧链中间体 (S)-CHBE的合成已成为研究热点，并取得了瞩目成果。然而，(S)-CHBE酶法生产工艺仍有不足之处，例如时空产率有待提高，多数反应依赖外源辅酶，有机溶剂及底(产)物对酶造成损伤等。而基因挖掘技术、分子改造技术及生物反应工程技术在 (S)-CHBE生产中的应用，使得新型羰基还原酶的开发及改造变得更为便利，也必将为酶法催化合成(S)-CHBE开辟新的前景。

表1 产(S)-CHBE的羰基还原酶[6,8-17]

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