吸水链霉菌valG基因的克隆与表达

刘 杰，包莹玲，陈小龙

(浙江工业大学 发酵工程研究所，浙江 杭州 310014）

井冈霉素能有效的抑制水稻、小麦和玉米等禾本科作物的纹枯病菌，自70年代开发至今，因其高效低毒的特性，已成为水稻纹枯病防治中最主要的药剂，也是国内生产量最大的微生物农药[1-2]。井冈霉素在我国已经使用了近40年，全国有30多家工厂生产[3]，年产量3万～4万吨，年防治面积约1000亿平方米。

井冈霉素中的主要活性组分为井冈霉素A。当前生产井冈霉素A的方法主要是微生物发酵。生物合成井冈霉素A的方法原料来源广泛并且对环境无污染，然而生产效率低、产量低、能耗高等问题一直是影响其扩大使用范围的重要因素。因此，本实验尝试运用生物工程技术手段，获得高效表达目的产物的菌株，提高井冈霉素A的产量。这对于降低企业生产成本，减少对环境的影响具有重要意义。

在研究生物合成井冈霉素A反应的限速步骤时，我们发现井冈霉素A的生产菌种在最后一步将井冈羟胺A转化为井冈霉素A的效率偏低，而催化此反应的酶为糖基转移酶。李磊[4]通过基因置换实验和回补实验证明基因valG编码的蛋白确实能行使糖基转移的功能。徐慧等[5]通过以井冈霉亚基胺A作为糖基受体，以UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-氮-乙酰氨基葡萄糖、UDP-葡萄糖醛酸和GDP-麦芽糖作为ValG的糖基供体，在Mg2+存在下反应，TLC检测反应产物发现，ValG可以利用UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖作为糖基供体，生成4''-表-井冈霉素A （4''-epi-validamycin A）。4''-表-井冈霉素A是井冈霉素A的同分异构体，包含半乳糖结构。

周祥等[6]通过接合转移的方法对糖基转移酶进行过量表达。但是，由于吸水链霉菌对外源DNA具有较强的限制性。不同质粒的转化效果具有较大差异，井冈霉素的产量并未得到明显提高。陈双雅等[7]对建立吸水链霉菌的转化系统进行过探究，证实了不同质粒的转化效率不同。于秀莲等[8]探究了吸水链霉菌原生质体的制备条件，得到了制备吸水链霉菌原生质体的最佳条件。

本实验尝试对糖基转移酶基因进行过量表达以提高井冈霉素A的产量。利用质粒DNA转化吸水链霉菌感受态细胞，所用质粒为穿梭质粒pIJ8630，该质粒具有红霉素强启动子PermE*，且有大肠杆菌和链霉菌的接合转导元件OriT，以及int和attP位点，可以整合到链霉菌基因组上与基因组一起复制。

1 材料与方法

1.1 菌株及质粒

Escherichia coli DH5α，E.coli ET12567，吸水链霉菌 （Sterptomyces hygroscopicus subsp.jinggangensis），pIJ8630 均由本实验室保存，pMD-19购自TaKaRa公司。

1.2 培养基与试剂等

限制性内切酶KpnⅠ，NotⅠ，T4DNA连接酶，DNA聚合酶，UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒和SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒等均购自上海生工生物工程公司；测序由华大基因公司提供。

发酵培养基：玉米粉50 g，黄豆饼粉40 g，酵母膏 10 g，NaCl 1 g，KH2PO41 g， 蒸馏水 1000 mL。

LB固体培养基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，琼脂 15 g，水 1000 mL，pH 7.0。

R2YE液体培养基：先按以下成分配制：蔗糖103 g，葡萄糖 10 g，蛋白胨 4 g，酵母浸出粉4 g，胰蛋白胨2 g，酪蛋白水解物1 g，K2SO40.25 g，MgCl2·2H2O 10.12 g，微量元素溶液 2.0 mL，蒸馏水1000 mL。上述培养基分装于250 mL锥形瓶中，每瓶 50 mL，灭菌(115℃，20 min)后加入下列溶液：KH2PO4（0.5%）1 mL，CaCl2（0.25 mol/L）8 mL，Tris·HCl(pH 值为 7.2)10 mL。

微量元素溶液（mg/L）：ZnCl240 mg，Na2B4O7·10H2O 10mg，FeCl3·6H2O 200 mg， (NH4)6Mo7O24·4H2O 10 mg，CuCl2·2H2O 10 mg， MnCl2·4H2O 10 mg，蒸馏水 1000 mL。

渗 透 压 稳 定 液 ：K2SO40.25 g，MgC12·6H2O 2g，蔗糖103 g，微量元素溶液2 mL，用蒸馏水定容至 800 mL，115℃灭菌 30 min。灭菌后加入：KH2PO4（0.5%）10 mL，CaCl2（0.25 mol/L）100 mL，Tris·HCl(pH 值为 7.2)100 mL。

Tris·HCl（pH 值为 7.2）溶液：称量 Tris 3.03 g,用蒸馏水70 mL溶解后,用浓盐酸调pH值为7.2，然后定容至 100 mL，115℃灭菌 30 min。

1.3 仪器

岛津LC-21AT高效液相色谱仪。

1.4 valG基因的PCR扩增和克隆

根据Genbank中糖基转移酶ValG的基因序列，设计了一对用于扩增valG基因的引物，

ValG F:5’-GGGGTACCATGCCCGGTGCGACATC-3’

ValG R:5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTCACCGCGAAGAGAC-3’

PCR扩增条件 ：94℃ 2 min，94℃ 45 s →55℃ 30 s→ 72℃ 1 min（30个循环），72℃延伸 10 min。PCR产物切胶后用胶回收试剂盒回收，连接到pMD-19载体，构建成的质粒pMD-19-valG转化E.coli DH5α感受态细胞进行蓝白斑筛选，使用小量细菌质粒抽提试剂盒提取克隆质粒，经KpnⅠ、NotⅠ双酶切验证为阳性克隆后测序。

1.5 穿梭质粒pIJ8630-valG的构建

测序结果正确的质粒以KpnⅠ、NotⅠ双酶切，回收valG基因并将其插入同样经KpnⅠ、NotⅠ双酶切处理的pIJ8630，酶切验证后测序，未发生移码的质粒即为构建成功的穿梭质粒pIJ8630-valG。

1.6 吸水链霉菌感受态细胞的制备

取10 mL菌液置于50 mL离心管中，3000 rpm离心10 min，收集菌丝体。弃去上清，在沉淀中加10 mL渗透压稳定液，3000 rpm离心10 min。重复洗涤菌丝体1次后加入10 mL渗透压稳定液。加溶菌酶（2 g/L）后置于37℃水浴中保温酶解1 h。在整个酶解过程中，每隔10 min轻轻振荡1次，以便促使原生质体从菌丝体上游离下来。酶解后，于3000 rpm离心 7 min，弃去上清液。加10 mL渗透压稳定液，洗净溶菌酶。经两层擦镜纸过滤后得到原生质体悬液。取一滴原生质体悬液于血球计数板上,在显微镜下准确计数，得到原生质体总数。

1.7 质粒DNA转化吸水链霉菌感受态细胞

根据要做的转化实验数，分装50 μL原生质体(大约1010/mL)于各个EP管中。加5 μL DNA溶液到原生质体中。立即加入200 μL含25%PEG的缓冲液，用微量移液器上下吹吸4次以使其充分混合。放置3 min，将转化后的悬液 (100～200 μL)涂布于2个已吹干的R2YE平板上。将平板置于28℃恒温培养。16 h后用含有抗生素的软营养琼脂倒上层平板上。4天后进行抗性菌落计数。挑取接合子，进行PCR反应验证。

1.8 HPLC检测井冈霉素A

通过HPLC检测发酵产物中井冈霉素A，分析valG基因的表达状况。将足量孢子接种到发酵培养基中，37℃摇床培养（180 rpm）48～72 h。 发酵液离心后取上清直接进行检测。选用ODSZHYPERSIL色谱柱，流动相为5 mmol/L磷酸氢二钠缓冲液：甲醇(HPLC级100%)=98：2(V:V)，流速1.0 mL/min，检测波长210 nm。

2 结果与分析

2.1 valG基因的PCR扩增和克隆

PCR扩增产物经琼脂糖电泳显示约为1269 bp的片段，见图1。

pMD-19-valG经KpnⅠ、NotⅠ双酶切处理显示2692 bp的载体和约1269 bp的插入片段，见图2。

图1 PCR扩增糖基转移酶基因

图2 重组质粒pMD-19-valG双酶切电泳结果

pMD-19-T Simple Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。具有PCR产物连接、克隆效率高的特点，并且菌落显示的时间短，克隆后更易进行蓝白斑筛选。因此，本实验首先通过TA克隆将目的基因片段插入pMD-19中，以便于穿梭质粒pIJ8630-valG的构建。

2.2穿梭质粒pIJ8630-valG的构建

将琼脂糖凝胶中回收的扩增产物用Kpn I和Not I进行酶切，割胶回收。控制DNA片段摩尔数是载体摩尔数的3～10倍，将目的片段与Kpn I和Not I双酶切后的载体 pIJ8630混合，16℃下 T4DNA连接酶连接过夜。

质粒pIJ8630-valG具有红霉素强启动子PermE*，且有大肠杆菌和链霉菌的接合转导元件OriT，以及int和attP位点，可以整合到链霉菌基因组上与基因组一起复制。首先将该质粒转化E.coli ET12567，在含有安普霉素的LB平板上获得抗性菌落，然后挑选单菌落进行液体培养。提取重组质粒，双酶切验证。结果表明，抗性菌落均含有重组质粒pIJ8630-valG，从而为质粒DNA转化吸水链霉菌感受态细胞准备了材料。

pIJ8630-valG经KpnⅠ、NotⅠ双酶切处理显示6.9kb的载体和约1269bp的插入片段，见图4。

图3 穿梭质粒pIJ8630-valG构建示意图

图4 重组质粒pIJ8630-valG双酶切电泳结果图

图5 重组吸水链霉菌DNA PCR电泳图

2.3 质粒DNA转化吸水链霉菌及验证

通过质粒DNA转化吸水链霉菌感受态细胞将质粒pIJ8630-valG转入吸水链霉菌中，用安普霉素覆盖4～5天后有白色接合转移子长出，将长出的接合转移子接种于无抗性的SFM平板上，培养5天挑取单菌落，即得到抗性正确的接合子。将筛选到的抗性正确的接合子提取DNA进行PCR验证。实验结果与预期吻合（见图5)，证明突变株构建成功。

由图6和7可知，重组菌株与出发菌株相比基本形态一致，质粒DNA转化后的重组菌菌落中间突起部分边缘的凹痕增大，并且有黑色素产生，菌落颜色变为灰黑色。图7为安普霉素抗性平板上的转化子单菌落。本实验发现质粒DNA转化吸水链霉菌感受态细胞较易得到大量转化子。可能由于吸水链霉菌在细胞壁被溶解后，通透性大大增强，有利于质粒的进入和表达。

2.4 突变株发酵液的HPLC检测

检测结果发现发酵液中井冈霉素A的产量为1.17 mg/mL，比出发菌株提高了11.2%，valG基因得到了表达。

3 讨论

井冈霉素自上世纪70年代以来，在很长时期内独霸我国水稻纹枯病防治的市场份额。但是，近年来，随着新型产品的不断涌现，井冈霉素的市场份额已经被逐步侵食。新型农药用量少、药效长，总体成本低于井冈霉素。因此，如何提高井冈霉素中有效成分井冈霉素A的产量，进一步降低生产成本成为亟待解决的问题。井冈霉素A由糖基转移酶基因valG编码的糖基转移酶将β-D-葡萄糖转移到井冈霉亚基胺A的4’-羟基位置生成。本文通过基因改造的方法成功构建了穿梭质粒pIJ8630-valG并导入吸水链霉菌中，使糖基转移酶基因valG得到正确表达。

4 结论与展望

图6 出发菌株

图7 重组菌株

本文通成功构建了穿梭质粒pIJ8630-valG并导入吸水链霉菌中，使糖基转移酶基因valG得到正确表达。证实了糖基转移酶基因valG在井冈霉素A的合成过程中的作用。提高了井冈霉素A的产量，为进一步利用糖基转移酶基因valG改造构建新的高产菌株提供了理论基础。

在进行质粒DNA转化吸水链霉菌时，不同质粒的效果会明显不同，日后可尝试通过构建多种质粒进行接合转移以期提高效率。另外，井冈霉素A合成的必须基因有八个，分别为valA、valB、valC、valG、valK、valL、valM 和 valN。可以探究其它基因的高拷贝菌株构建或者多个基因高拷贝菌株的构建以提高井冈霉素A的产量。

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