灰树花漆酶的双水相萃取及酶学性质

虞凤慧 徐泽平，2 刘圣鹏 冯文娟

（1.黄河三角洲京博化工研究院有限公司，山东 滨 州 256500；2.滨州市环境微生物技术工程研究中心，山东 滨 州 256500）

双水相萃取（aqueous two-phase extraction，ATPS）是近年来发展起来的一种分离提取技术，广泛应用于蛋白质［1］、酶等生物活性物质的分离、提取和纯化。该技术具有操作条件温和、容易放大、可连续操作［2］，且无有机溶剂残留等优点［3，4］。更重要的是双水相萃取避免了传统液—液萃取中生物活性物质与有机溶剂的直接接触，保护了其活性［5］，有研究［6］表明聚合物对颗粒或生物分子的结构不但没有破坏作用，反而有稳定作用。ATPS极具大规模应用的潜力。

漆酶（laccase，EC1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶［7，8］，具有独特的催化特性。在污水处理、食品加工、纸浆造纸、纺织等工业［9，10］以及有机合成等化学反应中具有巨大的应用前景，因此，随着对其研究的逐渐深入，已成为当今的热门研究课题之一［11］。漆酶广泛分布于植物、真菌、少数昆虫和细菌中［12，13］。在真菌中，担子菌是目前获得漆酶的主要来源。灰树花（Grifolafrondosa）属担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、树花菌属［14］，是一种药食两用珍稀菇类。灰树花能分泌多种具有生物活性的代谢产物［15］，一直以来，对它的研究多集中于灰树花多糖，而对灰树花漆酶的研究尚不多见。目前，灰树花漆酶的生产技术极不成熟，产品鲜有报道，主要是因为其酶活力通常很低，更重要的是提取、分离、精制效率低、酶易失活，这些问题亟待解决。传统方法，如盐析、微滤、超滤、离子交换层析等方法纯化漆酶，一般回收率低。与传统方法相比，ATPS法简单易行，易于除去杂质，提高酶的纯度且回收率高，有较大的工业应用潜力［16］。本试验选择PEG6000/（NH4）2SO4双水相体系对灰树花漆酶进行萃取分离效果的研究，同时对纯化后的灰树花漆酶进行酶学性质的研究。为灰树花漆酶的大规模生产、分离提取及应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

灰树花（Grifolafrondosa）GF-931菌株：本实验室保存。

1.1.2 培养基

种子培养基：土豆1%，麸皮2%，葡萄糖2%，玉米粉0.5%，蛋白胨 0.3%，酵母浸粉 0.15%，磷酸二 氢钾 0.05%，硫酸镁0.1%；

液体发酵培养基：土豆15%，可溶性淀粉1.5%，酵母浸粉0.3%，硫酸铵0.1%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸镁0.1%，硫酸铜0.012%。

1.1.3 主要试剂

2，2-联氮－二（3-乙基－苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）：分析纯，美国Sigma公司；

聚乙二醇（PEG）6000：化学纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

硫酸铵：分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司；

冰醋酸：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；醋酸钠：分析纯，天津市博迪化工股份有限公司。

1.1.4 仪器

低速大容量离心机：DL-5型，上海安亭科学仪器厂；

紫外可见分光光度计：UV-1700型，岛津（苏州）有限公司；

精密pH计：PHS-3C型，上海仪电科学仪器股份有限公司；

数显恒温水浴锅：HH-1型，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；

电子天平：FA2004型，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 灰树花漆酶粗酶液的制备

（1）种子培养：无菌条件下，取适量新鲜的PDA斜面保藏菌种接入种子培养基中，于28℃、200r/min条件下培养2 d，即为一级种子液。

无菌条件下，将适量一级种子液转接至种子培养基中，于28℃、200r/min条件下培养2d，即为二级种子液。

（2）液体发酵培养：无菌条件下，按10%的接种量，将二级种子液转接至发酵培养基中，于28℃、200r/min条件下培养8d，发酵液经4 000r/min离心10min，收集上清液，即为漆酶粗酶液，4℃保存备用。

1.2.2 双水相体系相图的绘制 精确配制40%（m/V）的（NH4）2SO4和80%PEG6000溶液。取一定量已配制好的PEG6000于一洁净试管中，加入0.5mL蒸馏水，缓慢滴加已配制好的（NH4）2SO4溶液，混匀，至试管内溶液开始出现混浊为止，记录加入（NH4）2SO4的体积和质量。然后计量加入适量蒸馏水，使体系澄清，继续向试管中滴加（NH4）2SO4溶液，使其再次达到混浊，如此反复操作。计算每次达到混浊时PEG6000和（NH4）2SO4在系统总量中的质量分数。以PEG6000的质量分数为纵坐标，（NH4）2SO4的质量分数为横坐标作图，即得到一条双节线［17］。

1.2.3 双水相萃取方法 根据双水相体系相图，选择可形成双水相的PEG6000与（NH4）2SO4的浓度。固定体系总质量为20g，向其中加入一定量的PEG6000、（NH4）2SO4溶液至所需质量分数，不足部分以蒸馏水补充，振荡混匀。然后向双水相体系中加入酶液至所需质量分数，振荡混匀2min。4 000r/min离心1 0min使快速分相。读取上、下相体积及测定酶活，按式（1）～（3）计算相体积比、酶分配系数和酶活收率。

式中：

R——相体积比；

V上——上相体积，mL；

V下——下相体积，mL。

式中：

K——酶分配系数；

U上——上相酶活，U/mL；

U下——下相酶活，U/mL。

式中：

Y——酶活收率，%；

R——相体积比；

K——酶分配系数。

1.2.4 双水相萃取条件的优化

（1）酶液添加量对漆酶萃取效应的影响：根据双水相体系相图，将质量分数为50%的PEG6000和质量分数为40%的（NH4）2SO4溶液配制成可形成双水相的浓度，按不同的添加量分别加入漆酶粗酶液，组成不同的双水相体系，进行酶液添加量对漆酶萃取效应影响的研究。

（2）PEG 6000质量分数对漆酶萃取效应的影响：以酶液的最佳添加量为基础，将质量分数为40%的（NH4）2SO4和质量分数为50%的PEG6000溶液配制成一系列含不同质量分数PEG的双水相体系，研究PEG6000质量分数对漆酶萃取效应的影响。

（3）（NH4）2SO4质量分数对漆酶萃取效应的影响：以酶液的最佳添加量、PEG6000最佳质量分数为基础，将质量分数为50%的PEG6000和质量分数为40%的（NH4）2SO4溶液形成一系列含不同质量分数（NH4）2SO4的双水相体系，研究（NH4）2SO4质量分数对漆酶萃取效应的影响。

（4）双水相体系pH对漆酶萃取效应的影响：以酶液的最佳添加量、PEG6000最佳质量分数、（NH4）2SO4最佳质量分数为基础，调节双水相体系pH 分别为3.5，4.5，5.0，5.5，6.0（自然），研究体系pH对漆酶萃取效应的影响。

（5）正交试验：根据单因素试验结果，选择影响漆酶萃取效应的主要因素，设计正交试验，确定最佳萃取条件。

1.2.5 漆酶酶活的测定 参照文献［18］，修改如下：将漆酶酶液用0.05mol/L、pH 5的醋酸—醋酸钠缓冲液稀释至适当倍数，于30℃水浴锅中保温7min，取2.3mL稀释酶液于比色皿中，再加入0.7mL 1mM ABTS溶液，两者迅速混匀，启动反应。于420nm下测定反应液前2min内吸光值的变化△A，按式（4）计算酶活。酶活定义为每秒钟氧化1 nmol ABTS所需要的酶量为一个活力单位U。

式中：

XL——酶活，U/mL；

△A——2min内吸光度的变化；

V1——总反应体积，3mL；

ε——ABTS吸光系数，0.036mL/（nmol/cm）；△T——反应时间，120s；

V2——酶液体积，2.3mL；

I——光程，1cm；

n——稀释倍数。

1.2.6 漆酶的酶学性质研究

（1）漆酶的最适反应温度：经双水相萃取纯化后，按照1.2.5方法测定纯化漆酶酶活。设定漆酶的不同反应温度为30，35，45，55，65，75，100 ℃，以 测 定 的 最 高 酶 活 力 作 为100%，计算其他不同温度下漆酶的相对酶活。

（2）漆酶的热稳定性：设定漆酶的保温温度分别为30，35，45，55，65，75，100℃，分别保温2h，按照1.2.5方法测定纯化漆酶剩余酶活力，以最高酶活力作为100%，计算不同温度下漆酶剩余酶活力的相对酶活。

（3）漆酶的最适反应pH：用0.05mol/L醋酸和醋酸钠溶液分别配制成pH 2.97，3.50，4.00，4.50，5.00，5.50，6.00，7.00的缓冲液，并以此不同pH梯度的缓冲液分别稀释漆酶酶液以及配制相应的1mM ABTS底物。在最适反应温度下，按照1.2.5方法测定纯化漆酶酶活，以最高酶活力作为100%，计算不同pH下漆酶的相对酶活。

（4）漆酶的pH稳定性：用0.05mol/L醋酸和醋酸钠溶液分别配制成 pH 2.97，3.50，4.00，4.50，5.00，5.50，6.00，7.00的缓冲液，并以此不同pH梯度的缓冲液分别稀释漆酶酶液以及配制相应的1mM ABTS底物。在最适反应温度下，分别保温2h，按照1.2.5方法测定纯化漆酶剩余酶活力，以最高酶活力作为100%，计算不同pH下漆酶剩余酶活力的相对酶活。

（5）金属离子对漆酶酶活性的影响：用0.05mol/L醋酸和醋酸钠溶液配制最适pH的缓冲液，加入不同的金属盐，配制成金属离子浓度为5mmol/L的缓冲液。在最适温度和最适pH条件下，按照1.2.5方法测定酶活，以不加入金属离子的酶活力作为100%，计算加入不同金属离子的漆酶相对酶活。

2 结果与分析

2.1 PEG6000/（NH4）2SO4体系的相图

由图1可知，此双节线图即为PEG6000/（NH4）2SO4双水相体系的相图。双节线上的点为临界区，线的下方为均相区，线的上方为两相区，即可形成双水相体系，其中T、B点连线称为系线，T为上相组成，B为下相组成，由此可得知形成双水相时PEG6000与（NH4）2SO4质量分数的具体配比关系，以此选择不同的萃取体系进行漆酶萃取效应的研究。

2.2 酶液添加量对漆酶萃取效应的影响

图1 PEG6000/（NH4）2SO4双水相体系相图Figure 1 The phase diagram of aqueous two-phase system PEG6000/（NH4）2SO4

图2 酶液添加量对漆酶萃取效应的影响Figure 2 The effect of adding amount of enzyme on extraction of laccase with aqueous two-phase system

由图2可知，随着漆酶酶液添加量的增加，相体积比变化不明显，分配系数和酶活收率呈先增后减的趋势，当酶液添加量为10%时，分配系数和酶活收率最高，分别为4.4和86.4%，此时漆酶的萃取效果最好。因此，选择酶液的最佳添加量为10%。

2.3 PEG6000质量分数对漆酶萃取效应的影响

由图3可知，随着PEG6000质量分数的增加，相体积比先缓慢增加后趋于平缓，分配系数和酶活收率呈逐渐增大趋势。PEG6000质量分数为22%时，分配系数和酶活收率最高，分别为13.0和95.3%，即漆酶的萃取效果最好。已有研究［19］表明，当（NH4）2SO4质量分数一定时，随着 PEG 质量分数的增加，酶的分配系数增加，酶活收率也同时增加，增加PEG相的质量分数对分离是有利的。因此，选择PEG6000的最佳质量分数为22%。

图3 PEG6000质量分数对漆酶萃取效应的影响Figure 3 The effect of mass fraction of PEG6000on extraction of laccase with aqueous two-phase system

2.4 （NH4）2SO4质量分数对漆酶萃取效应的影响

由图4可知，随着（NH4）2SO4质量分数的增加，相体积比逐渐减小，后趋于平稳，分配系数逐渐增大，而酶活收率呈先减后增趋势，当（NH4）2SO4质量分数为17%时，酶分配系数和酶活收率最高，分别为5.4和85.5%。因此，选择（NH4）2SO4的最佳质量分数为17%。

2.5 pH对漆酶萃取效应的影响

图4 （NH4）2SO4质量分数对漆酶萃取效应的影响Figure 4 The effect of mass fraction of（NH4）2SO4on extraction of laccase with aqueous two-phase system

图5 pH对漆酶萃取效应的影响Figure 5 The effect of pH on extraction of laccase with aqueous two-phase system

由图5可知，当调节体系pH为3.5至5.5时，分配系数和酶活收率都很低，而体系pH为6.0（自然）时，分配系数和酶活收率明显增大，分别为5.5和91.1%，因此选择双水相体系最佳pH为自然，即不进行pH调节。

2.6 双水相萃取体系的正交优化

根据单因素试验结果，选择酶液添加量、PEG6000质量分数和（NH4）2SO4质量分数为三因素，按照表1设计L9（33）正交表，正交试验结果见表2。由表2可知，各因素对PEG6000/（NH4）2SO4体系萃取漆酶的影响主次关系为RA＞RC＞RB，即酶液添加量对萃取效率的影响最大，其次为（NH4）2SO4质量分数和PEG6000质量分数。另外，从极差来看，RD（空列）＞RB，说明试验中有一定的误差，是否还有其他因素比PEG6000质量分数对漆酶萃取效果的影响大，有待进一步验证。最优组合为A1B3C2，即当酶液添加量为5%，PEG6000质量分数为25%，（NH4）2SO4质量分数为17%时，漆酶的萃取效果最佳，并在此最佳萃取条件下进行验证实验，得到漆酶的分配系数和酶活收率分别高达7.6和96.6%，说明正交试验优化出的最佳萃取条件较好。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels for orthogonal design/%

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experimental design

2.7 漆酶的酶学性质研究

2.7.1 漆酶的最适反应温度 由图6可知，在45℃时纯化漆酶的酶活最高，之后酶活明显降低，至100℃时酶活几乎为0。因此，确定纯化漆酶的最适反应温度为45℃。

图6 漆酶的最适反应温度Figure 6 The optimal temperature of the purified laccase activity

2.7.2 漆酶的热稳定性 由图7可知，在30，35，45℃分别保温2h后，漆酶的剩余相对酶活分别为78.2%，86.7%，74.4%，稳定性较好，而在55℃保温2h后其相对酶活仍剩余65.3%，由此表明，纯化漆酶在30～55℃范围内具有一定的稳定性，其中在30～45℃范围内，热稳定性较好。

2.7.3 漆酶的最适反应pH 由图8可知，在最适反应温度45℃时，反应pH为2.97时漆酶的酶活最高，之后酶活迅速下降，pH为4时相对酶活仅为61.0%，由此确定，在测定条件下，漆酶的最适反应pH为2.97。

图7 漆酶的热稳定性Figure 7 The thermostability of the purified laccase activity

2.7.4 漆酶的pH稳定性 由图9可知，纯化漆酶在p H 3.5～5.0时稳定性较好，保温2h，剩余相对酶活均在72.7%～87.7%，在pH 5.5条件下保温2h，相对酶活仍为66.0%，之后酶活逐渐降低，pH 7时酶活几乎为0。由此可知，纯化漆酶在pH 3.5～5.0时稳定性最好。

图8 漆酶的最适反应pHFigure 8 The optimal pH of the purified laccase activity

图9 漆酶的pH稳定性Figure 9 The purified laccase stability under different pH

2.7.5 金属离子对漆酶酶活性的影响 由图10可知，与对照相 比 （不 加 金 属 离 子），金 属 离 子 Cu2＋、Zn2＋、Mg2＋、Mn2＋、K＋、Ca2＋对漆酶酶活有较好的促进作用，其中 Cu2＋和Mg2＋促进作用最显著，其相对酶活分别达150.0%和148.0%。而Co2＋、Fe2＋、Na＋则对漆酶酶活有很大的抑制作用，其中Fe2＋抑制作用最明显，其相对酶活仅为2.0%。

图10 金属离子对漆酶酶活的影响Figure 10 The effects of metal ions on the laccase activity

3 讨论

本实验室通过灰树花GF-931菌株的液体发酵，灰树花漆酶的酶活力可达200～300U/mL，直接冷冻干燥酶活达3万U/g，采用ATPS法对其进行分离纯化，显著降低了酶损失的同时，更提高了其纯度，稳定了酶活性。

本试验采用PEG6000/（NH4）2SO4双水相体系对灰树花漆酶进行萃取效应的研究。通过单因素试验研究酶液添加量、PEG6000质量分数、（NH4）2SO4质量分数和体系pH对灰树花漆酶萃取效应的影响，通过正交试验进一步优化萃取条件。试验结果表明：在pH为6（自然）时，漆酶最佳萃取条件为酶液添加量5%，PEG6000质量分数25%，（NH4）2SO4质量分数17%，在此最佳萃取条件下进行验证实验，漆酶的分配系数和酶活收率分别高达7.6和96.6%。说明该技术能够用于灰树花漆酶的分离纯化。

对双水相萃取纯化的漆酶进行了酶学性质研究，由试验结果可知，纯化漆酶的最适反应温度为45℃，在30～45℃时热稳定性最好；最适反应pH为2.97，在pH 3.5～5.0时具有较好的稳定性。金属离子 Cu2＋、Zn2＋、Mg2＋、Mn2＋、K＋、Ca2＋对漆酶酶活有促进作用，其中Cu2＋和Mg2＋促进作用最强；而Co2＋、Fe2＋、Na＋则抑制漆酶酶活，其中Fe2＋的抑制作用最明显。

本试验利用ATPS法进行了灰树花漆酶的萃取，确定了最佳萃取条件，并进行了纯化漆酶的酶学性质研究，为漆酶的系统研究及工业化生产和应用提供了理论依据。

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