从啤酒废酵母中提取甘露聚糖的工艺条件优化

2014-12-20孔凌云史咏华

食品与机械 2014年5期

孔凌云史咏华吴炜邵伟

（1.三峡大学生物与制药学院，湖北宜昌 443001；2.河南南街村集团技术中心，河南临颖 462600）

中国是酿酒大国，其发酵液及其酵母壁原料多，一般用作饲料或废弃［1］。啤酒废酵母是提取多种生化物质及生化药物的宝贵资源［2］。酵母细胞壁主要由β－葡聚糖和甘露聚糖组成，甘露聚糖占酵母细胞壁干重的40%左右［3］。甘露聚糖具有增加动物体液免疫和细胞免疫能力，能调节肠道菌群平衡，选择性吸附霉菌毒素，具有抗辐射、抗氧化、抗肿瘤，改善血清脂质，降低胆固醇含量，防止便秘，改善多种消化系统疾病等功能，是一种极具市场潜力的食品添加剂［4，5］。甘露聚糖目前在食品工业中作为胶凝剂、增稠剂和保水剂而被广泛应用［6］。采用全细胞制备酵母多糖的传统方法具有酸碱用量大、回收成本高，容易破坏多糖结构等缺点［7－10］，不利于工业化大规模生产。目前，以啤酒废酵母为原料提取甘露聚糖的工艺存在用碱量过多、收率低、成本高等方面的不足。因此，优化与改进现有工艺条件就显得尤为重要。为此，本研究拟采用正交试验方法，以甘露聚糖得率为评价指标，以自溶后的酵母细胞壁为原料，优化建立甘露聚糖提取工艺，以期提高提取率、减轻后期的纯化压力，而且降低碱的用量，减少对多糖的降解，使其保持较高生理活性，以期为啤酒废酵母甘露聚糖的规模化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

新鲜啤酒酵母：由河南南街村集团南德啤酒厂提供；甘露糖标准品：纯度≥99%，上海源叶生物科技有限公司；

其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

电子天平：ALC-210.4型，北京赛多利斯仪器系统公司；

pH计：pHS-3C型，上海雷磁仪器厂；

高压均质机：SRH60-70型，上海申鹿均质机有限公司；

立式压力蒸汽灭菌器：YXQ-LS-30SII型，上海博迅实业实限有限公司；

离心机：TGL-20LM型，湖南星科科学仪器有限公司；

紫外－可见分光光度计：Varian Cary50型，美国瓦里安技术公司。

1.3 甘露聚糖提取方法

1.3.1 甘露聚糖提取工艺

啤酒废酵母→预处理→自溶→均质→NaOH提取→脱蛋白→乙醇醇析→乙醚、丙酮洗涤→干燥→成品

1.3.2 操作要点

（1）啤酒废酵母的预处理：按1∶1（V∶V）的比例将纯净水加入啤酒废酵母泥中进行洗涤，并经100目筛子过筛，然后以3 000r/min离心10min，如此3次，以除去其中的酒花等杂质［11，12］，收集洗净的酵母泥。

（2）自溶：称取一定量的酵母泥，按料水比1∶4（m∶m）的比例加入纯净水，制成酵母悬液，添加适量2%NaCl、p H 4.5的醋酸—醋酸钠缓冲液，于45～50℃保温搅拌自溶1 8h。

（3）均质：将自溶液以3 000r/min离心10min，得沉淀物，按料水比1∶3（m∶m）的比例加入纯净水，制成酵母细胞壁悬液，在40MPa条件下进行均质处理（均质进料温度70℃），再以3 000r/min离心10min，得酵母细胞壁沉淀物。

（4）提取：称取酵母细胞壁，添加不同质量浓度的NaOH配成不同的料液比，并在不同的温度及时间下浸提，3 000r/min离心10min取上清液，用20%的醋酸溶液中和至pH 7.0，搅拌10min，离心取上清液。

（5）脱蛋白：将提取后获得的含甘露聚糖的上清液中加入10%浓度的三氯乙酸溶液，调pH为3，4℃冰箱冷藏静置过夜，离心脱蛋白。

（6）精制干燥：向脱蛋白后的溶液中加入2倍体积无水乙醇过夜，离心取沉淀物，分别用乙醚、丙酮洗涤，60℃干燥得甘露聚糖成品。

1.4 试验方法

（1）料液比的影响：取2.5g酵母细胞壁各5份，添加3%的 NaOH分别制成料液比为1∶10，1∶12.5，1∶15，1∶17.5，1∶20（m∶V）的悬浮液于90℃浸提2h，测甘露聚糖含量。

（2）NaOH浓度的影响：取2.5g酵母细胞壁各5份，分别添加浓度为1%，2%，3%，4%，5%的NaOH配成料液比1∶15（m∶V）的悬浮液，90℃浸提2h，测甘露聚糖含量。

（3）浸提时间的影响：取2.5g酵母细胞壁各5份，添加浓度为3%的NaOH制成料液比为1∶15（m∶V）的悬浮液，于90℃分别浸提1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h，测甘露聚糖含量。

（4）浸提温度的影响：取2.5g酵母细胞壁各5份，添加浓度为3%的NaOH配成料液比为1∶15（m∶V）的悬浮液，分别于60，70，80，90，100℃下浸提2h，测甘露聚糖含量。

1.5 测定方法

（1）甘露聚糖含量的测定：参照文献［13］，以紫外分光光度法进行测定。

（2）样品处理：称取20mg左右的酵母甘露聚糖，碾磨溶解于2.5mL 72%H2SO4中，室温放置3h，加蒸馏水使硫酸的最终浓度为4mol/L左右，然后100℃酸水解4h，取出冷却至室温，用 NaOH调pH至中性，再用0.2mol/L p H 7.0磷酸缓冲液定容至100mL。

（3）标准曲线的制作：参照文献［13］的方法绘制标准曲线。

（4）样品甘露聚糖浓度的测定：吸取0.2mL样液，参照文献［13］的方法于280nm测吸光值，求得△OD，以标准曲线计算甘露糖浓度，从而得出甘露聚糖浓度。

（5）甘露聚糖提取率的计算：

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

以甘露糖为标准样品，紫外分光光度法测定其吸光度，绘制的甘露糖标准曲线见图1。

图1 甘露糖标准曲线Figure 1 Standard curve of mannose

标准曲线方程为y＝0.001 5x－0.027 07（y为△OD，x为甘露糖质量浓度μg/mL），相关系数R2＝0.996 3。

2.2 料液比对甘露聚糖提取率的影响

图2 料液比对甘露聚糖提取率的影响Figure 2 Effects of different solid-liquid ratio on the extraction rate of mannan

由图2可知，当料液比小于1∶15（m∶V）时，甘露聚糖提取率随料液比的增加而增加；当料液比为1∶15（m∶V）时，甘露聚糖提取率最大，说明在料液比较低时，提取液尚未充分发挥作用，碱提不彻底；料液比高于1∶15（m∶V）时，提取液不足，影响提取效果。因此，以1∶15（m∶V）为提取甘露聚糖的较佳料液比。

2.3 NaOH浓度对甘露聚糖提取率的影响

由图3可知，当NaOH添加量小于2%时，由于碱的水解，使可溶性的甘露聚糖溶出，低浓度碱对甘露聚糖的提取具有促进作用；当NaOH添加量大于2%时，提取出的甘露聚糖被高浓度的碱降解，而且碱浓度越大对甘露聚糖的破坏越厉害，损失也越大。故选择质量浓度2%的NaOH作为提取啤酒废酵母甘露聚糖的添加量。

图3 NaOH浓度对甘露聚糖提取率的影响Figure 3 Effects of different concentration of NaOH on the extraction rate of mannan

2.4 浸提时间对甘露聚糖提取率的影响

由图4可知，浸提时间小于1.5h时，NaOH发挥水解作用，使细胞壁上的甘露聚糖溶出，但由于时间较短，提取尚未结束，所以呈现上升趋势；当浸提时间大于1.5h时，随着碱提时间的延长，甘露聚糖降解，提取率降低。因此，选择1.5h作为提取甘露聚糖的浸提时间。

2.5 浸提温度对甘露聚糖提取率的影响

由图5可知，浸提温度不同，甘露聚糖提取率也不同。当温度低于90℃时，甘露聚糖提取率随温度的升高呈上升趋势，说明在温度比较低的时候反应不彻底，碱提不充分；温度高于9 0℃时，随着温度的继续升高，碱提过程中溶出的甘露聚糖又会被降解，破坏多糖结构，使提取率呈现下降趋势。因此，选择9 0℃为提取甘露聚糖的浸提温度。

图4 浸提时间对甘露聚糖提取率的影响Figure 4 Effects of different time on the extraction rate of mannan

图5 浸提温度对甘露聚糖提取率的影响Figure 5 Effects of different rate of mannan

2.6 甘露聚糖提取工艺条件的优化

根据单因素试验结果，选择料液比、NaOH浓度、浸提时间、浸提温度等因素进行考察，并以甘露聚糖提取率为考察指标，建立正交试验因素水平表见表1，正交试验结果与分析见表2。

表1 正交试验因素水平表Table 1 The design of the head of table L9（34）

表2 L9（34）正交试验结果与分析Table 2 L9（34）orthogonal array design arrangement and experimental results

由表2可知，影响甘露聚糖提取效果因素的主次顺序为：D＞A＞C＞B，通过极差分析可以确定甘露聚糖提取工艺的最佳条件为 A3B2C1D3，即料液比为1∶17.5（m∶V），NaOH浓度为2%，浸提时间为1.0h，浸提温度为9 0℃。

对试验结果进行方差分析，结果见表3。

表3 正交试验方差分析结果Table 3 Analysis of variances for extraction yield of polysaccharides with various extraction conditions

＊差异显著（P＜0.05）。

来源偏差平方和自由度 F比显著性（α＝0.05）A 24.084 2 0.973＊ 99.02 8 B 10.071 2 0.407 C 22.260 2 0.899 ＊D 42.605 2 1.721 ＊误差

由表3可知，因素A、C和D在P＜0.05的水平上有显著性差异，因素B不显著。

2.7 最佳提取条件的验证

根据确定的甘露聚糖提取最佳工艺条件，对啤酒废酵母进行甘露聚糖提取，做3次平行提取实验，并对所提取的甘露聚糖进行含量测定，其甘露聚糖平均提取率可达到1 8.15%，低于表2中试验8的18.88%的提取率，说明试验中存在一定的试验误差、各因素间存在交互作用。

3 结论

本研究以啤酒废酵母为原料，通过单因素试验，考察了不同料液比、NaOH浓度、浸提时间、浸提温度对酵母甘露聚糖提取效果的影响，并在此基础上进行了L9（34）正交试验，确定的最优工艺参数为料液比1∶17.5（m∶V），NaOH浓度2%，浸提时间1.0h，浸提温度90℃。在此条件下制备甘露聚糖，所得甘露聚糖平均提取率为18.15%。由此可见，以自溶后的酵母细胞壁为试材提取甘露聚糖，不仅操作简单、经济廉价，而且减少了碱的用量，提高了提取率，这与梁新乐等［5］使用浓度6%的NaOH，甘露聚糖提取率6.63%相比，碱用量降低了4%，而提取率提高了3倍左右；与朱红蕾等［8］使用浓度5%的NaOH，甘露聚糖提取率4.4%相比，碱用量降低了3%，提取率提高了4倍左右。该方法在操作上减少了碱的用量，提高了啤酒废酵母甘露聚糖的提取率，可做为工业化生产酵母甘露聚糖的技术参考。

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