环境因子对豆腐特定腐败菌消长特性的影响

范文教 孙俊秀 陈云川 易宇文 刁 潘

（1.四川旅游学院食品科学系，四川 成都 610100；2.四川大学化学工程学院，四川 成都 610065）

豆腐含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素B1、B2和微量元素等营养物质［1］。因其营养丰富、水分含量高，给微生物的生长繁殖创造良好条件，引起吲哚、硫化氢、有机酸等一系列腐败代谢产物的积累，从而造成豆腐腐败变质，可以说豆腐腐败主要是微生物活动的结果［2］。在大多数情况下，豆腐中所含微生物中只有部分微生物参与这个腐败变质过程，这些在豆腐腐败变质中快速生长繁殖并产生腐败代谢产物的微生物，就是豆腐的特定腐败菌［3］。由于豆腐的特定腐败菌与豆腐品质和货架期之间存在密切关系，在实际生产过程中往往可以通过控制特定腐败菌生长繁殖来改善产品品质，延长产品货架期。因此，研究不同环境因子对这些特定腐败菌的消长特性并揭示其间的内在联系，是建立豆腐制品品质安全控制措施的基础和关键。

食品的防腐技术主要核心是基于阻止残留的腐败菌和致病菌的生长繁殖。在实际生产过程中将不同防腐技术的原理归结于少数几个因子，然后针对这些因子的防腐特性，综合研究抑制引起食品腐败的微生物的措施，并形成对特定腐败微生物的多样化协同，达到强化防腐保鲜的作用［4］。尽管目前对豆腐中特定腐败菌坚强芽孢杆菌的形态特性以及生化信息表达有所研究，但对其消长特性规律特别是在特定环境下的因子对消长特性规律的影响还鲜有报道。例如李博等［3］以天然豆浆为培养基，研究GDL豆腐中坚强芽孢杆菌的生长曲线，初步确定其生长曲线的初级模型，但研究并未涉及环境因子对坚强芽孢杆菌消长特性的影响。本研究拟以豆腐中分离纯化得到的特定腐败菌（坚强芽孢杆菌）为研究对象，考察加热强度、pH、钙离子浓度以及水分活度等环境因子对其消长特性的影响，旨在为研究豆腐制品生产和贮运过程中特定腐败菌的控制技术提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌种：由南豆腐（购于成都市光荣豆制品厂）中分离得到的特定腐败菌坚强芽孢杆菌；

营养肉汤：生化试剂，市售；

豆浆培养基：豆浆样品于121℃灭菌20min，低温储藏备用；

豆腐培养基：豆腐样品碾碎后于121℃灭菌20min，低温储藏备用。

1.2 试验仪器

无菌操作台：SW-CJ-1BU型，苏州博兰特实验室系统工程有限公司；

电热恒温培养箱：KXB-11A型，上海仪器厂；

数显恒温水浴锅：ZC-18型，中山市远禾电器公司；

数字式移液枪：DP64528型，美国Dragon公司。

1.3 菌种活化

将坚强芽孢杆菌接种于无菌营养肉汤上，于37℃培养24h后，60℃水浴30min将菌种活化，然后根据试验需求做成适宜的稀释度。

1.4 试验设计

1.4.1 热处理强度对坚强芽孢杆菌的影响 取1mL活化菌悬液接种于装有9mL豆浆培养基的试管中，振荡均匀后于水浴中进行不同强度热处理，每隔5～30min取样，迅速冷却后进行平板菌落计数。试验中以豆浆培养基作为空白对照。

1.4.2 钙离子浓度对坚强芽孢杆菌的影响 取1mL活化菌悬液接种于装有9mL不同钙离子浓度豆浆培养基的试管中，振荡均匀后于92℃水浴中处理20min，迅速冷却后进行平板菌落计数。试验中以空白豆浆培养基作为空白对照。

1.4.3 pH值对坚强芽孢杆菌的影响 取1mL活化菌悬液接种于装有9mL不同pH豆浆培养基的试管中，振荡均匀后于92℃水浴中处理20min，迅速冷却后进行平板菌落计数。试验中以空白豆浆培养基作为空白对照。

1.4.4 水分活度对坚强芽孢杆菌的影响 取1mL活化菌悬液接种于装有10g豆腐培养基的试管中，滴入不同量的豆浆培养基，振荡均匀后于92℃水浴中处理20min，迅速冷却后进行平板菌落计数。试验中以豆腐培养基作为空白对照。

1.5 数据处理

试验数据用originlab 8.6统计分析软件进行方差分析和Duncan多重检验法来检验平均值间的差异显著性，并作图。

2 结果与分析

2.1 热处理强度对坚强芽孢杆菌消长特性的影响

温度是影响微生物生长的最重要的因素之一。在豆腐生产过程中，高强度的热处理工序主要有煮浆和保温成型［5］。由图1可知，同一热处理强度下，坚强芽孢杆菌的残存菌数随着处理时间的增加而呈递减趋势；同一处理时间下，坚强芽孢杆菌的残存菌数随着热处理强度的增加也呈递减趋势。从残存菌数的递减幅度上分析，当热处理强度为9 0℃时，残存菌数下降的幅度最缓慢，在100min内菌体总数降低仍未达到一个数量级；而热处理强度为92，94，96，9 8℃时，残存菌体总数下降约一个数量级的时间分别为70，45，20，10min。结果表明，一定热处理强度对坚强芽孢杆菌的消长特性有显著影响，特别是在热处理强度在96℃以上，即使热处理时间不长，坚强芽孢杆菌残存菌数也很低。

图1 不同热处理强度对坚强芽孢杆菌消长特性的影响Figure 1 Effects of different heat treatment intensity on growth characteristics of Bacillus firmus

2.2 钙离子浓度对坚强芽孢杆菌消长特性的影响

图2 钙离子浓度对坚强芽孢杆菌消长特性的影响Figure 2 Effects of different concentration of Ca2＋on growth characteristics of Bacillus firmus

豆腐生产过程中的点浆就是加入凝固剂成型的过程，常用的凝固剂有石膏、盐卤以及葡萄糖酸－δ－内酯等，相应生产的豆腐为嫩豆腐（南豆腐）、老豆腐（北豆腐）、内酯豆腐［6］。本试验根据所加入的凝固剂石膏，来分析不同钙离子浓度对坚强芽孢杆菌消长特性的影响。由图2可知：钙离子浓度在0～2.0%（m/V）范围时，坚强芽孢杆菌残存菌数变化不明显，在热处理过程中钙离子浓度对坚强芽孢杆菌的消长特性不显著。Jiang-Gong等［7］在研究不同凝固剂对豆腐品质的影响中认为：钙或钠离子对豆腐特定腐败菌的消亡影响不大。在煮浆过程中，钙或钠盐类的存在会增加豆浆的饱和度，降低豆腐成型后的水分活度，从而增加坚强芽孢杆菌的耐热性；此外，豆浆中钙或钠离子强度的增加会提高整个环境的水分活度，促使坚强芽孢杆菌热敏性的增加。这与Laroche等［8］研究认为盐类对微生物耐热性的影响具有多样性相符。不同梯度钙离子浓度的坚强芽孢杆菌残存菌数不同，其原因主要是因为硫酸钙在充当凝固剂时，点浆成型后豆腐水分活性或点浆过程所需时间的差异造成的；此外，部分差异也可能由平板计数的误差带来的。

2.3 pH值对坚强芽孢杆菌消长特性的影响

一般来说，微生物的生长pH值范围极广，但是绝大多数种类都生活在pH 5.0～9.0［9］。由图3可知，以pH 6.6为临界点，随着pH值的增加或降低，坚强芽孢杆菌菌体的残存菌数明显减少。说明在热处理过程中pH对坚强芽孢杆菌消长规律影响显著。有研究［10］表明酸碱度对微生物消亡特性的影响，主要表现在影响微生物细胞自身细胞膜表面电荷的性质及膜的通透性，或者改变整个培养基中营养物质的离子化程度，影响营养物质的吸收平衡，或者彻底改变细胞本身的酶促反应速率及代谢途径。

图3 pH值对坚强芽孢杆菌消长特性的影响Figure 3 Effects of different pH on growth characteristics of Bacillus firmus

2.4 水分活度对坚强芽孢杆菌消长特性的影响

微生物生长都需要一定的水分。研究［11］表明：特定微生物的生长局限于所在介质的水分活度。一般来说，只有当环境中的水分活度大于某一临界值时，微生物才能正常的生长繁殖。

由图4可知：随着水分含量的增加，坚强芽孢杆菌菌体的残存菌数也呈增加趋势，但增量不明显，表明在热处理过程中不同水分活度对坚强芽孢杆菌消长特性有一定影响。

3 结论

图4 水分活度对坚强芽孢杆菌消长特性的影响Figure 4 Effects of different moisture content on growth characteristics of Bacillus firmus

环境因子对豆腐特定腐败菌坚强芽孢杆菌的消长特性具有不同程度的影响。本研究通过试验分析了加热强度、pH、钙离子浓度、水分活度这4个环境因子对豆腐特定腐败菌坚强芽孢杆菌消长特性的影响。结果表明，热处理强度和pH对坚强芽孢杆菌消长规律影响显著，水分活度对坚强芽孢杆菌消长规律有一定的影响，钙离子浓度的影响不显著。因此，在保证豆腐品质的条件下，这些环境因子对豆腐特定腐败菌消长特性，可为豆腐制品生产和贮运过程中特定腐败菌的控制技术提供参考数据。

1 李晓东.功能性大豆食品［M］.北京：化学工业出版社，2006.

2 李除夕，董明盛，陈晓红，等.豆腐中库特氏菌生长动力学模型和货架期预测［J］.农业工程学报，2009，25（Supp.1）：82.

3 李博.GDL豆腐中主要腐败菌的研究及HACCP的建立［D］.北京：中国农业大学，2002.

4 张佳敏，王卫，唐仁勇.泡椒凤爪防腐保藏及栅栏因子调控研究［J］.食品工业科技，2014，32（2）：291～295.

5 卢义伯，潘超，祝义亮.豆腐生产中不同制浆工艺研究［J］.食品工业科技，2007，28（8）：182～184.

6 中国国家标准化管理委员会.GB/T 22106—2008 非发酵豆制品［S］.北京：中国标准出版社，2009.

7 Jiang-Gong Liu，Tser-Sheng Lin，Wun-Yuan Lin.Evaluating the growth of Listeria monocytogenes that has been inoculated into tofu containing background microflora［J］.Food Control，2010，21（12）：1 764～1 768.

8 C Laroche，F Fine，P Gervais.Water activity affects heat resistance of microorganisms in food powders［J］.International Journal of Food Microbiology，2005，97（3）：307～315.

9 李宗军.压力 温度处理对肉制品中微生物的影响［J］.食品与机械，2006，22（3）：14～16.

10 M C Rojo，F N Arroyo López，M C Lerena，et al.Effects of pH and sugar concentration in Zygosaccharomyces rouxii growth and time for spoilage in concentrated grape juice at isothermal and non-isothermal conditions［J］.Food Microbiology，2014，38（3）：143～150.

11 曾锋，张立彦，曾庆孝.微生物对食品防腐剂的抗药性研究进展［J］.食品与机械，2005，21（2）：51～53.