Nr4a2过表达慢病毒载体的构建及鉴定*

王晓晓 付文玉 庄文欣 王倩 刘宗昱 刘金城

(1.潍坊医学院人体解剖与组织胚胎学省级重点实验室 山东潍坊 261053;2.潍坊医学院组织学与胚胎学教研室 山东潍坊 261053;3.潍坊医学院医学研究实验中心 山东潍坊 261053)

孤儿核受体Nr4a2(又称Nurr1/NOT/TINUR),属于核甾体/甲状腺激素受体超家族成员,是一类独立的核受体转录因子[1]。研究发现NR4A2基因对中脑多巴胺(dopamine,DA)能神经元的分化和存活起关键作用。本实验构建过表达Nr4a2基因的慢病毒质粒,以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为报告基因,动态观察NR4A2在转染细胞内的表达、分布及效应,为基因治疗帕金森病(Parkinson’s disease,PD)提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

健康Sprague-Dawley(SD)大鼠,由山东鲁抗医药股份有限公司质检中心实验动物室(实验动物生产许可证号:SCXK鲁20130001)提供;293T细胞由我院免疫学重点实验室惠赠,GV287载体,AgeI/AgeI酶切,pHelper1.0载体、pHelper2.0载体均购自上海吉凯基因化学技术有限公司;大肠杆菌DH5α、无内毒素质粒中提试剂盒购自康为世纪有限公司;PCR扩增引物、Trizol RNA提取试剂盒、购自上海生工生物技术服务有限公司;逆转录试剂盒、高保真Prime STARTM HS DNA Polymerase、限制性内切酶、DL2000 DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司;D M E M-高糖培养基、O p t i-M e M、Lipofectamine2000 Reagent购自Life technologies公司。

1.2 仪器与设备

PCR仪、低温超速离心机、紫外分光光度计、倒置荧光显微镜为德国Eppendorf公司产品;BiospectrumAC凝胶成像分析系统为美国UVP公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 Nr4a2目的基因片段的获取

根据NCBI发表的大鼠Nr4a2基因序列,设计合成一对引物。Nr4a2上游引物:5’GAG GAT CCC CGG GTA CCG GTC GCC ACC ATG CCT TGT GTT CAG GCG 3’,Nr4a2下游引物:5’TCC TTG TAG TCC ATA CCG AAA GGT AAG GTG TCC AGG 3’,由上海吉凯基因有限公司合成,该对引物所扩增的Nr4a2基因条带大小为1838bp。

1.3.2 重组慢病毒质粒GV287-Nr4a2的构建

用限制性内切酶AgeI/AgeI对纯化的GV287质粒进行酶切,将纯化回收的1838bp大小的目的片段与酶切后线性化的GV287质粒用T4DNA连接酶连接,4℃过夜。转化DH5α感受态细菌后,涂板,挑取阳性单克隆接种到5mlLB液体培养基中,37℃振荡培养约12h,用小量质粒回收试剂盒抽提质粒。PCR反应鉴定阳性细菌克隆,并将阳性克隆的菌液送测序。

1.3.3 重组慢病毒质粒GV287-Nr4a2的包装及滴度检测

将重组慢病毒质粒GV287-Nr4a2(20μg)、pHelper1.0载体(15 μg)、pHelper2.0(10μg)的混合液经Opti-MeM 2.5ml稀释后,室温静置5min后与Lipofectamine2000混匀,室温静置20min,将混合液转移至293T细胞培养液中,37℃、5%CO2常规培养8h后换液,收集转染后48h的293T细胞上清。4℃,4000g离心,过滤上清于过滤器中,4000g离心15min,收集病毒浓缩液并送上海吉凯基因有限公司进行滴度检测,通过比较对照组和样品组的Ct值差异判断滴度值,通常认为Ct值相差2以上存在显著差异。

1.3.4 慢病毒LV-Nr4a2瞬时转染293T细胞

以5×104细胞/ml密度接种293T细胞于6孔板中(每孔1ml),37℃,5%CO2条件下常规培养达到30%-50% 融合后,以病毒滴度为1×107,MOI=10将LV-Nr4a2感染293T细胞,转染6h后更换普通培养基,常规培养72h后于倒置荧光显微镜下观察感染效率。

2 结果

2.1 PCR扩增Nr4a2基因片段及阳性克隆的鉴定结果

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析,基因片段的大小为1838bp,与预期一致。将扩增的目的基因Nr4a2交换入线性化GV287载体后,PCR鉴定结果表明,阳性转化子PCR产物大小约为1838bp,与预期相符。对PCR鉴定成功的阳性转化子GV287-Nr4a2克隆送上海生工进行测序,测序结果经VectorNTI软件与Nr4a2基因Genebank登录序列比对,碱基序列完全一致。

2.2 慢病毒滴度检测结果

在本次滴度检测中,10-4μl组与对照组样品的Ct值存在2个左右差异,因此可以认为在10-4μl组中存在病毒颗粒。假定该组样品中含有至少1个病毒颗粒,则病毒的滴度为1/(1.0×10-4μl)×20＝2.0×105TU/μl＝2.0×108TU/ml。

2.3 慢病毒感染293T细胞的效率

图一 293T细胞感染慢病毒质粒LV-Nr4a2 72h后结果A:转染慢病毒质粒LV-Nr4a2 (荧光100× )C:转染慢病毒质粒LV-Nr4a2(100×)B:转染慢病毒质粒LV-Nr4a2 (荧光200× )D:转染慢病毒质粒LV-Nr4a2(200×)

慢病毒感染293T细胞72h后,倒置荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光的表达,表明慢病毒成功感染293T细胞并成功表达Nr4a2蛋白。(见图一)

3 讨论

慢病毒载体是以人类免疫缺陷型病毒为基础发展起来的基因治疗载体,通过自身RNA为模板在反转录酶的作用下合成双链DNA,并通过整合酶作用将目的基因整合到宿主染色体上。本实验采用的慢病毒载体系统由GV287载体、pHelper1.0载体、pHelper2.0载体组成,其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,同时不受细胞分裂影响,其可以在体内较长期地表达且安全性高。由于上述载体均为假型病毒,病毒感染目的细胞后不再具有感染能力,也不会在宿主细胞内产生新的病毒颗粒［2］。因此该慢病毒系统具有较好的安全性、靶向性。

近年来研究显示,Nr4a2基因与中脑黑质DA能神经元前体细胞向DA能神经元方向分化及DA能神经元发育成熟、迁移和存活关系密切[3-4]。转染Nr4a2基因的骨髓MSCs[5]、神经干细胞[6]可以成功分化为DA能神经元并且移植治疗PD动物模型有效,本实验通过重组慢病毒技术成功构建了过表达Nr4a2基因的慢病毒载体,浓缩后的病毒颗粒成功转染293T细胞,倒置荧光显微镜下可以观察到细胞内EGFP的高度表达,感染效率达到70%,证明质粒构建合理并在细胞中具有良好表达活性。

综上所述,本研究采用重组慢病毒技术成功构建重组慢病毒质粒GV287-Nr4a2,为进一步获得稳定表达Nr4a2蛋白的骨髓间充质干细胞模型奠定了基础。

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[6]Tan XF,Tian ML,Jin GH,et a1.The induced differentiation of neural stem cells into dopaminergic neurons by Nurrl gene overexpression[J].Acta Anatomica Sinica,2011,42(2):18-23.Chinese.