海红果多糖水提醇沉工艺及其抑菌活性研究*

吴敬，王英丽，宝冠媛，郭海燕，李丽杰，王越男

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特，010018)

海红果，学名西府海棠(Malus micromalus Makino)又名海红、海红子、子母海棠、小果海棠，属于蔷薇科(Rosaceae)梨亚科(Pomoideae)苹果属［1-2］，主要分布在我国的蒙晋陕三(区)省交界的黄土丘陵沟壑地区［3］。海红果营养丰富，除含有基本的营养成分外，还含有16种氨基酸，其中富含缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸及婴幼儿生长必要的组氨酸、精氨酸，且钙的含量居于水果之冠，素有“钙王”之美誉［3-4］。近年来市场上出现的以海红果为主要原料的保健制品，已被证明在补钙、补锌、促进大脑发育、软化血管、降低血脂有较好作用，有些地区甚至以海红代替山楂入药［3-4］，这些都为其开发奠定了良好理论基础。

近些年，植物多糖的多种生物活性包括抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗辐射、抗突变、降血糖、增强免疫等［6-7］已被证实。郝志鹏等研究表明海红果多糖(PFM)有较强的抗氧化能力［8］。为了进一步研究海红果多糖的功效，本文对海红果多糖的醇沉工艺进行研究，并探讨其对蜡样芽孢杆菌CGMCC1.1686、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌的抑菌效果，以期为海红果的综合利用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

海红果:秋季摘果，洗净、阴干、粉碎后过60目筛，干燥贮存，备用;苯酚，葡萄糖，浓硫酸，无水乙醇，均为分析纯;营养肉汤培养基，YPD培养基，胰酪胨蛋白胨培养基，参照文献配制［9-10］。

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cerecus CGMCC1.1686)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus GMCC1.1923)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC(B)26112)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus CMCC(B)28001)、大 肠 杆 菌 (Escherichiacoli ATCC25922)、沙门氏菌(Salmonella typhimuniuns)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes CMCC54002)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25923)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)由内蒙古农业大学食品科学与工程学院实验室提供。

1.2 试验仪器与设备

T6-新锐可见分光光度计，美国惠普公司;AL204型电子分析天平(十万分之一)，梅特勒-托利多仪器公司;TG-16-WS型台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;HH.S 1-Ni型电热恒温水浴锅，北京长安科学仪器厂;DHG-9075A型真空干燥箱，上海-恒科学有限公司;LTI-601SD型恒温培养箱，东京理化器械株式会社;XC189-HY-08小型高速粉碎机，西化仪(北京)科技有限公司HY-08。

1.3 实验方法

1.3.1 水提醇沉法提取海红果多糖(PFM)

精确称取样品粉末1.00 g，加入10倍体积的无水乙醇浸泡24 h后，离心，滤渣加入一定体积的蒸馏水，回流提取2次，抽滤，合并滤液后再离心(10 000 r/min，15 min)，加入95%的乙醇，使多糖液的含醇量为80%，在冰箱中醇沉12 h。将沉淀溶液在20℃下以10 000 r/min离心15 min，离心后弃上清液，沉淀再分别用无水乙醇和80%的乙醇洗涤2次，离心后弃去上清液，即得海红果粗多糖粗品，备用。

1.3.2 PFM提取的单因素和正交试验

利用回流提取技术，分别考察提取温度、料液比、提取时间及醇沉比对提取样品中多糖含量的影响。试验料液比选取 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 五个水平，提取时间选取 30、60、90、120、150 min 五个水平，提取温度选取 75、80、85、90、95℃ 五个水平，醇沉浓度选取60%、70%、80%、90%、99.9%四个水平，分别进行单因素试验，重复3次。在单因素试验基础上，选出适宜的提取温度、提取时间、料液比和乙醇浓度进行正交试验。

1.3.3 PFM 含量测定

以葡萄糖为对照品，采用改良的苯酚-硫酸显色法测定总多糖含量［8，11］。

具体方法:精密吸取葡萄糖工作液(0.1 mg/mL)0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，各加蒸馏水至 2.0 mL，再加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 mL，混合摇匀，室温放置10 min，然后置沸水浴加热15 min，取出冷却至室温。在波长490 nm处测吸光度，空白对照是以蒸馏水代替葡萄糖溶液。以葡萄糖质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标制作标准曲线。葡萄糖标准曲线方程:y=0.1556x-0.0362(R2=0.9966)。根据标准曲线计算粗多糖含量:

式中:C待为待测样的浓度，mg/mL;m样为待测样的质量，g。

1.3.4 PFM 的抑菌试验

(1)菌悬液的制备［12-14］:将实验细菌分别接种于营养肉汤液体液体培养基中，37℃培养箱中培养18～24 h后，以2%的接种量再活化1代，用0.85%无菌生理盐水梯度稀释，制成106CFU/mL菌悬液，冰箱4℃保存待用。

(2)抑菌试验:称取PFM 7.5 g，用无菌水配制成质量浓度为75 mg/mL的PFM溶液。将此多糖溶液分别稀释成 50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL 系列质量浓度溶液。

采用双层琼脂平板扩散法检测抑菌活性。即在灭菌平皿内倒入10 mL的灭菌水琼脂，使其铺满平板底部。待平板内培养基冷却凝固后，放入牛津杯;取含菌约106CFU/mL的指示菌悬液200 μL加入到软琼脂培养基中，混匀后倾注到灭菌的平皿内，待培养基凝固后，取出牛津杯，在孔中加200 μL海红果多糖溶液，室温扩散3～5 h，37℃培养18 h，同时以无菌水为阴性对照，每种质量浓度做3次重复。用游标卡尺测量抑菌圈的直径，读数精确至0.01 mm。判定标准抑菌环直径大于8.1 mm者判为有抑菌作用，抑菌环小于或等于8 mm者判为无抑菌作用［13］。阴性对照组应无抑菌环产生，否则试验无效。

2 结果与分析

2.1 海红果粗多糖回流提取的单因素试验结果

2.1.1 料液比对多糖提取的影响

在提取时间60 min，提取温度90℃的条件下，考察料液比为 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 对多糖提取效果的影响，结果如图1。

图1 料液比对多糖提取效果的影响Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction yield of PFM

由图1可看出，在料液比1∶10～1∶30范围内，随着料液比的增加，多糖提取量明显上升，这是由于料液比越大，海红果细胞内外的多糖浓度差就越大，溶质的扩散动力增加，传质推动力大则利于多糖的浸出;当料液比达1∶25时，多糖已基本溶出，继续增加料液比，多糖含量增加不明显，且会增加杂质的浸出率，也会增加后续加工成本。综合考虑各方因素，提取以料液比1∶20 ～1∶30 为宜。

2.1.2 提取时间对多糖提取的影响

在料液比为1∶30，提取温度90℃的条件下，分别考察提取时间为30、60、90、120、150 min 对多糖提取效果的影响，结果如图2。

由图2可以看出，提取时间为30～90 min时，多糖提取量随时间延长而增大，但90 min后随着提取时间的延长而降低。这是因为随着提取时间的延长，部分多糖降解为单糖、寡糖或低聚糖，它们可溶于乙醇，在醇沉过程中有所损失，故提取率下降。因此，提取时间以30 min为宜。

图2 提取时间对多糖提取效果的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of PFM

2.1.3 提取温度对多糖提取的影响

在料液比为1∶30，提取30 min，分别考察温度为75、80、85、90、95 ℃ 对多糖提取效果的影响，结果如图3。

图3 提取温度对多糖提取效果的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield of PFM

由图3可以看出，温度是影响多糖提取的关键因素之一，在75～85℃，海红果多糖含量随温度的升高而增加。这是因为随着提取温度的升高，样液黏度降低，组织中的多糖向提取液中的传质速率增加，有利于组织中的多糖浸出。当温度高于85℃，海红果多糖含量开始下降，这是因为多糖的热稳定性下降，导致多糖分解。因此，将提取温度确定为80～90℃。

2.1.4 乙醇体积分数对多糖提取的影响

在提取次数为1次，料液比为1∶30，提取时间为30 min，提取温度为85℃的条件下，分别考察乙醇体积分数分别为60%、70%、80%、90%、99.9%对多糖提取效果的影响，结果如图4。

由图4可以看出，海红果多糖提取量随乙醇体积分数的增加而增加，在使用60%体积分数的乙醇沉淀时，多糖的得率相对较低;用70%体积分数的乙醇沉淀时，多糖的提取量有所提高;而用80%体积分数以上的乙醇沉淀时，样品中的多糖提取量显著增加。其原因可能是在低浓度乙醇沉淀时，沉淀下来的可能主要是高分子量的多糖;中等体积分数乙醇沉淀下来的可能是中等分子量的多糖［15］。综合考虑多种因素，选择最适乙醇体积分数为80% ～99.9%。

图4 乙醇体积分数对多糖提取的影响Fig.4 Effect of alcohol concentration on extraction yield of PFM

2.2 海红果多糖提取的正交试验结果与分析

根据上述单因素的试验结果进行正交试验，各因素水平的选取及结果见表1。

表1 海红果多糖的L9(34)正交试验结果Table 1 The results of the orthogonal experiment of PFM

根据极差分析法，由表1中的试验结果可知，本试验中4个影响因素(料液比，时间，温度，醇沉浓度)对多糖含量影响的顺序为:RA＞RC＞RB＞RD，即A因素(料液比)为最重要的因素，其次为C因素(提取温度)和B因素(提取时间)，D因素(乙醇浓度)影响最小。最优试验条件的组合是A2C3B2D1，即料液比1∶25，提取温度为90℃，提取时间60 min，乙醇体积分数80%。与单一影响因素相比，使用复合影响因素(A2C3B2D1)所得多糖的提取量较高。以正交试验所确定的最优水平组合做验证试验，PFM含量为105.15 mg/g。

2.3 海红果多糖抑菌试验结果

采用双层琼脂平板扩散法研究海红果多糖对B.cerecus CGMCC1.1686、Geobacillus stearothermophilus GMCC1.1923、S.aureus CMCC(B)26112、Micrococcus luteus CMCC(B)28001、E.coli ATCC25922)、Saccharomyces cerevisiae、L.monocytogenes CMCC54002、S.aureus ATCC25923八种试验菌的抑制效果，以抑菌圈直径的大小为衡量指标，试验结果见表2。

由表2可知，海红果多糖在浓度75 mg/mL和50 mg/mL 时对 B.cerecus CGMCC1.1686、Saccharomyces cerevisiae、L.monocytogenes CMCC54002 均有抑菌作用，在浓度25 mg/mL时仅对Saccharomyces cerevisiae、L.monocytogenes CMCC54002有抑菌性，而且，多糖浓度越小，抑菌效果越弱。除上述菌外，海红果多糖浓度在75 mg/mL以下时，均对Geobacillus stearothermophilus GMCC1.1923、S.aureus CMCC(B)26112、MicrococcusluteusCMCC(B)28001、 E. coli ATCC25922、S.aureus ATCC25923、Saccharomyces cerevisiae无抑菌作用。

表2 海红果多糖抑菌结果Table 2 Antimicrobial results of PFM

3 结论

本实验通过3水平4因素正交试验，确定了提取海红果多糖的最佳工艺条件，即为:料液比1∶25(g∶mL)，提取温度90℃，提取时间 60 min，乙醇浓度80%，在此条件下多糖含量105.15 mg/g。4个单因素对多糖含量的影响顺序为:料液比＞提取温度＞提取时间＞乙醇浓度。

通过抑菌试验表明，海红果多糖仅对B.cerecus CGMCC1.1686、Salmonella typhimuniuns、L.monocytogenes CMCC54002有良好的抑菌作用，且对3株菌的最低抑菌质量浓度分别为50 mg/mL、25 mg/mL、25 mg/mL;对 Geobacillus stearothermophilus GMCC1.1923、S.aureus CMCC(B)26112、Micrococcus luteus CMCC(B)28001、E.coli ATCC25922、S.aureus ATCC25923、Saccharomyces cerevisiae无抑菌作用。其具体原因和作用机制需要在今后的研究中继续探索。

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