小麦制酒精残渣发酵菌种筛选及其产物小肽的抗氧化活性*

康连虎，李吕木，，司雄元，李彬，郭文杰，穆华，丁小玲，许发芝

1(安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥，230036)2(安徽农业大学生物技术中心，安徽 合肥，230036)

3(安徽瑞福祥食品有限公司，安徽 亳州，236800)4(安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥，230036)

以小麦为原料生产酒精的过程中，小麦经过粉碎、水洗、发酵以及蒸馏等过程生产出酒精，同时产生了酒精糟液，酒精糟液经过离心分离，下层沉淀烘干做小麦干酒糟(小麦DDG)，上清液加入絮凝剂絮凝后过滤得浮渣，滤液进行沼气生产后得沼渣，浮渣和沼渣的产量大，且沼渣异味大，如直接丢弃势必对环境造成很大污染。经测定，浮渣和沼渣烘干后粗蛋白含量分别在27%和35%左右，丢弃处理实属极大的浪费。为了实现这部分资源的饲用化，近年来，安徽瑞福祥食品有限公司将菌泥与浮渣和麸皮混合，接种酒曲菌种进行发酵，以降低菌泥的异味，提高其饲用品质。但由于酒曲中菌种繁多，功能菌不够明晰，不符合国家对发酵产品的微生物要求。同时酒曲发酵不耐高含水量(55%左右)而两种残渣含水量均在85%左右，这就要求在发酵时还需要添加大量吸水物料，如麸皮来降低整体含水量，而麸皮的添加又降低了发酵产物的蛋白含量。因此，优选高效耐水分的饲用微生物进行菌泥和浮渣的发酵，以去除其异味和提高其饲用品质，对实现菌泥和浮渣无害化处理和资源化利用具有重要意义。安徽瑞福祥食品有限公司在先前的固态发酵浮渣和沼渣进行饲用开发过程中发现发酵产物中富含小肽，已有研究证实有些小肽可以直接被吸收，且吸收的效果要比氨基酸好［1］，有些小肽还具有特殊的生物活性功能如抑制血压升高［2］、抗疲劳［3］、增强免疫功能［4］及降低胆固醇［5］等作用，而这些作用均与其抗氧化性质有关。为此，本研究通过对发酵菌种和发酵条件的优化，以及发酵产物中小肽抗氧化活性研究，为开拓浮渣和菌泥的饲用开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

浮渣、沼渣、酒曲和麸皮，由安徽瑞福祥食品有限公司提供;地衣芽孢杆菌 D-1、枯草芽孢杆菌 KG-109，由安徽农业大学饲料科技研究所提供。

蓝色葡聚糖-2000、L-酪氨酸、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽，北京索莱宝科技有限公司;Sephadex G-15，北京瑞达恒辉科技发展有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，上海源叶生物技术有限公司。

豪华型面包发酵箱，广州市海缔机械科技有限公司;752紫外-可见分光光度计，上海浦东物理光学仪器厂;DHL-A电脑恒流泵、HD-21-1核酸蛋白检测仪、SBS-100自动液相色谱层析仪，上海青浦沪西仪器厂;层析柱(2.6 cm×60 cm)，上海锦华层析设备厂;多功能有机膜实验设备，合肥世杰膜工程有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 固态发酵

试验以菌泥、浮渣为原料，辅以麸皮，使用本实验室保存的耐水和盛产蛋白酶的饲用微生物菌种地衣芽孢杆菌D-1、枯草芽孢杆菌KG109和混合菌种酒曲3种出发菌进行固态好氧发酵，依次为处理1、2和3，处理1和处理2的接种量设3%和6%两个梯度，每个梯度含水量设50%、60%、70%三个水平，处理3按照瑞福祥公司先前优化的酒曲最优发酵条件不变，即接种量10%，物料水分50%，菌泥:浮渣∶麸皮=10%:10%∶70%(以干物质计)。共 13个组合(表1)。将原料混匀后在垫有无纺布的有孔不锈钢托盘内堆成20×20×20的料堆在面包箱内进行发酵，初始发酵温度34℃，每3个小时测1次温度，每12 h翻盘通风，发酵48h。发酵结束后取样65℃烘干制样测水分、粗蛋白和酸溶蛋白含量。以物料水分高和产小肽量多为最优组合，其样品用于后续的小肽分离纯化及其抗氧化活性研究。

表1 发酵组合Table 1 Combinations cf fermentation

1.2.2 小肽粗提

准确称取物料水分高和产小肽多的最优组合残渣发酵物20g加180 mL纯水，搅拌混匀浸提20 min，滤纸过滤后取滤液8 000 r/min离心15 min，取上清液过0.45 μm滤膜，取滤液过1 000 Da纳滤膜，得到分子质量小于1 000 Da部分浓缩备用。

1.2.3 小肽分离纯化

采用Sephadex G-15葡聚糖凝胶层析柱对小肽粗体液进行分离纯化。层析柱(2.6 cm×60 cm)，小肽粗提液质量浓度为30 mg/mL，上样量为l.0 mL，使用双蒸水做洗脱液，流速为0.5 mL/min，检测波长为280 nm。

1.2.4 标准曲线绘制

采用任颖和彭惠惠等［6-7］的方法。

1.2.5 小肽含量测定

采用 Lowry-福林酚法［8］，重复测定2次。

1.2.6 体外抗氧化指标测定

DPPH自由基清除作用的测定、·OH清除作用的测定和还原力测定均采用彭惠惠等［7］方法。

1.3 数据统计

实验中数据用x±s表示，使用Microsoft Excel表格整理计算，使用SAS 9.1对结果进行分析，P＜0.05和P＜0.01分别表示差异显著和极显著。

2 结果与分析

2.1 发酵物指标检测

菌种、接种量和物料水分对产物酸溶蛋白和粗蛋白的影响见表2，可见酸溶蛋白含量和粗蛋白含量均是3组和6组显著高于其他组(P＜0.01)，但3组和6组差异不显著(P＞0.05)，而3组接种量较少，因此3组的发酵条件即为最优组合，即选择D-1为菌种，3%接种量，含水量70%。此组发酵样绝干状态下粗蛋白含量31.75%，酸溶蛋白含量14.63%。

表2 菌种、接种量和物料水分对产物酸溶蛋白和粗蛋白的影响Table 2 Effect of strains，inoculum content and moisture on acid soluble protein and crude protein of fermentation production

2.2 标准曲线的绘制

测得外水体积V0=81.50 mL，总体积Vt=221.80 mL，L-酪氨酸(M=181.19)、还原型谷胱甘肽(M=307.32)、氧化型谷胱甘肽(M=612.6)的洗脱体积Ve分别为258.43、185.21、111.82 mL。所作标准曲线如图1所示，拟合得到回归方程:y=-0.506 3x+2.885 0，式中y为标准品相对分子质量的对数(lgM)，x为Kav系数，Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0)。回归方程的相关系数为0.994 3，说明lgM与Kav线性关系较好。

图1 lgM与Kav系数标准曲线Fig.1 The standard curve of lgM and Kav

2.3 Sephadex G-15检测小肽的相对分子质量分布

小肽粗提液经过Sephadex G-15凝胶色谱柱分离，出现5个峰，如图2所示，各个峰的洗脱体积分别是72.43、88.35、130.31、158.52、199.21 mL，代入标准曲线拟合的方程，得到5个组分的分子质量分别为827、725、512、405、289 Da，即小肽粗提液分离得到的5 个组分为八肽、七肽、五肽、四肽、三肽。继续分离纯化并将收集的5个组分冷冻保存，作下一步分析使用。

图2 小肽Sephadex G-15柱层析洗脱图谱Fig.2 Elution profile of small peptide on Sephadex G-15

2.4 小肽对DPPH·的清除作用

由图3可知，在高质量浓度(1.0 mg/mL)条件下小肽粗提液的DPPH自由基清除率极显著(P＜0.01)高于2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT);但在低质量浓度(0.1 mg/mL)条件下，小肽粗提液的DPPH·清除率与BHT差异不显著。表明小肽具有进一步开发为高效抗氧化剂的潜力。

图3 小肽粗提液与BHT清除DPPH自由基能力的比较Fig.3 Scavenging capacity of small peptide and BHT on DPPH free radicals

由图4可知，小肽粗提液及分离得到的七肽、五肽、四肽和三肽均具有清除DPPH·的能力，并且在试验所设梯度范围内，随着质量浓度的增加DPPH·清除能力也在增加。四肽、五肽与小肽粗提液对DPPH·的清除能力接近且较高，七肽次之，三肽较弱。在高质量浓度下，四肽、五肽的DPPH·清除率达到80%左右，小肽粗提液的DPPH·清除率超过90%。而八肽不具有清除DPPH·的能力。根据四肽、五肽和七肽对DPPH·清除的能力的规律，初步可以推断对于质量浓度相同、分子质量不同的小肽而言，清除DPPH·的能力随着小肽分子质量的减小而增大。上述结果与彭惠惠和范远景等［8，10-11］关于“小分子质量多肽的抗氧化活性要明显高于大分子质量的多肽”的研究结果一致。这主要是因为抗氧化活性肽含有某些能与自由基反应的特殊基团即供氢基团，只有当小肽在适当分子质量时，这些特殊的供氢基团才能得到最大的暴露充分与自由基作用，此时才具有较强的抗氧化性。由于八肽不具有抗氧化活性且溶液自身有一定的颜色，所以当DPPH溶液中加入一定浓度的八肽时，八肽溶液自身的颜色导致吸光度没有减小反而增大，因此显示清除率为负值。

图4 小肽对DPPH·清除作用的比较Fig.4 Scavenging capacity of small peptide on DPPH free radicals

2.5 小肽对·OH的清除作用

从图5可以看出，在试验所设梯度(0.1～1 mg/mL)范围内，小肽粗提液及分离得到的七肽、五肽、四肽和三肽对·OH均有清除作用，并且在较低浓度范围内，随着质量浓度的增加，小肽对·OH的清除作用也随之增强，当达到一定浓度后，质量浓度增加而清除率不再继续增加。小肽中含有供氢体，具有提供质子的能力，使具有高度氧化性的自由基还原，从而达到终止自由基连锁反应，起到清除或抑制自由基的目的，因此，随着质量浓度的增加，供氢体增多，提供质子的能力增强，其抗氧化性也就会随之提高。当达到一定浓度后，·OH已经接近完全清除而不再增加。在高质量浓度下，凝胶层析分离所收集的组分中，四肽清除·OH能力最强接近100%，粗提液和五肽清除率均达到90%以上。三肽较弱，在质量浓度为0.4 mg/mL时，清除·OH能力在34%左右，且随着质量浓度的增加而没有明显的增强。八肽不具有清除·OH的能力。

图5 小肽对·OH清除作用的比较Fig.5 Scavenging capacity of small peptide on hydroxyl free radicals

2.6 小肽还原力

由图6可知，除了八肽的其他各组分在试验所设梯度(0.5～5 mg/mL)范围内总还原力与质量浓度呈线性关系。随着小肽质量浓度的增加，小肽的抗氧化性也随之增强;凝胶层析分离所收集的各组分中，四肽的还原力最强，这一结果与清除DPPH·、·OH活性一致。以还原型谷胱甘肽作为对照，其总还原力高于小肽各组分。5 mg/mL的小肽粗提液和四肽与0.5 mg/mL谷胱甘肽的吸光度相近，说明这些物质的总还原力相近。

图6 小肽还原力的比较Fig.6 Total reducing power of small peptide

大量研究资料证明，炎症、肿瘤、衰老、血液病以及心、肝、肺、皮肤等各方面疑难疾病的发生机理均与体内自由基产生过多或清除自由基能力下降有着密切的关系［10］。为此，高效、天然无毒的抗氧化剂一直是研究人员致力研究的课题。本实验中从固态发酵浮渣和沼渣所得产物中提取的小肽粗提液以及分离出的大多数肽组分均具有较强的清除自由基的能力。由以上3种抗氧化实验结果分析可以看出，在不同的实验体系中，四肽抗氧化能力最强，在水系中小肽总还原力低于谷胱甘肽，但在油系中小肽清除DPPH自由基活力高于BHT，因此小肽在油脂抗氧化方面值得今后深入研究。对于还原力较强的四肽、五肽和七肽，对·OH和DPPH自由基均具有较强的清除作用，且抗氧化能力随着小肽分子质量的降低而增强，可见小肽的抗氧化活性与其分子质量存在相关关系。然而，三肽和八肽抗氧化能力很弱或基本为零，且与抗氧化能力随着小肽分子质量的降低而增强的规律并不相符，可能是由于多肽的抗氧化能力与构成肽的氨基酸种类、数量及氨基酸排列有关。许多氨基酸及其衍生物有清除自由基的能力，如:Lys、His、Tyr、Met、Pro、Arg、Glu、Cys等，而含有 Tyr、His、Lys、Pro 等氨基酸的多肽一般具有较强的抗氧化活性［11-12］。而本实验中分离出的三肽和八肽中可能只含有少量的或不含有抗氧化活性较强的氨基酸，因此其抗氧化能力很弱以至于不具有清除DPPH·和·OH的能力。

小肽富含供氢体，具有提供质子的能力，可以使具有高度氧化性的自由基还原，从而终止自由基链式反应，起到清除或抑制自由基的目的。这些都可能是小肽具有较强抗氧化作用的原因，但其详细的抗氧化机理和构效关系还需要进一步研究。

3 结论

地衣芽孢杆菌D-1是提高小麦制酒精残渣饲用品质的高效发酵菌种，其固态发酵过程中产生的小肽中大部分具有较强抗氧化活性。

［1］ Clemente A.Enzymatic protein hydrolysates in human nutrition［J］.Trends in Food Science Technology，2000，11(7):254-262.

［2］ Bhuyan B J，Mugesh G.Antioxidant activity of peptide-based angiotensin converting enzyme inhibitors［J］.Organic Biomolecular Chemistry，2012，10(11):2 237-2 247.

［3］ PAN Daodong，GUO Yuxing，JIANG Xiaoyun.Anti-fatigue andantioxidative activies of peptides isolated from milk proteins［J］.Journal of Food Biochemistry，2011，35(4):1 130-1 144.

［4］ Mikami N，Matsushita H，Kato T，et al.Calcitonin generelated peptide is an important regulator of cutaneous immunity:effect on dendritic cell and T cell functions［J］.Journal of Immunology，2011，186(12):6 886-6 893.

［5］ Bielicki J K，Zhang H Y，Cortez Y，et al.A new HDL mimetic peptide that stimulates cellular cholesterol efflux with high efficiency greatly reduces atherosclerosis in mice［J］.Journal of Lipid Research，2010，51(6):1 496-1 503.

［6］ 任颖，柳春.生物化学与分子生物学实验教程［M］.北京:清华大学出版社，2012.

［7］ 彭惠惠，李吕木，钱坤，等.发酵芝麻粕中芝麻小肽的分离纯化及其体外抗氧化活性［J］，食品科学，2013，34(9):66-69.

［8］ Brown R A.An appreciation of the Folin-Lowry protein assay［J］.The Journal of Pharmacy and Pharmacology，1992，44(4):369.

［9］ 范远景，高海成，孟凡莉.抗氧化活性花生肽的氨基酸组成及质谱分析［J］. 食品科学，2011，32(13):32-36.

［10］ 李怡歆.自由基与人体健康［J］.中国科技信息，2008(10):106.

［11］ 胡文琴，王恬.酪蛋白酶解物体外抗氧化作用的研究［J］. 食品科学，2004，25(4):158-162.

［12］ 齐继成.我国生物活性肽的开发应用前景［J］.中国医药技术与市场，2004，1(4):22-23.