培养基组成对布拉氏酵母生长的影响及其优化

杜晓蒙，陶如玉，圣志存，贾士儒

（教育部工业发酵微生物重点实验室，天津科技大学，天津300457）

布拉氏酵母是法国科学家HenriBoulard于1923年从印尼水果荔枝中分离得到的一株适温、非毒性酵母菌株，一般认为是酿酒酵母的亚种[1]。目前布拉氏酵母广泛用于预防和治疗各种腹泻、肠道炎症[1-2]。药代动力学研究显示，连续口服之后，布拉氏酵母能够在结肠内稳定存在3天左右，停药之后则会随粪便排出，不会在肠道内定植[3-4]。另外，使用细菌作为益生菌的最大危险是其可能会将耐药基因传给致病菌，而酵母不存在此类问题，是安全的微生态调节剂[5]。在许多国家，布拉氏酵母作为冻干产品用于预防儿童和成人的腹泻[2，6]。此外，布拉氏酵母制剂还能够增强微生态平衡，刺激免疫系统，作为饲料添加剂的应用已得到包括中国在内的许多国家的认可，因此在畜牧业中必将有广阔的应用前景[7-10]。

作为微生态制剂，要保证其生物疗效，肠道内必须达到足够数量的活菌数，因此本文以布拉氏酵母菌为菌株，研究了不同培养基成分、培养条件对其生物量积累的影响，初步确定最有利于菌体生长的培养条件，之后利用正交试验确定益生菌布拉氏酵母的最适摇瓶培养条件[11]，为其活菌制剂的生产制备提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

布拉氏酵母菌由天津科技大学生化工程研究室分离筛选。

1.1.2 培养基

种子培养基：葡萄糖4%，蛋白胨1%，pH5.0；初始发酵培养基：葡萄糖4%，蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH5.0。

1.2 方法

1.2.1 培养过程及生物量测定

挑取布拉氏酵母接种至种子培养基中，30℃，200 r/min振荡培养12 h后，以7%接种至发酵培养基中，振荡培养24 h，取样测其生物量及残糖含量[12]。

1.2.2 单因素试验

分别以碳源种类、氮源种类、磷酸二氢钾浓度、硫酸镁浓度为影响因素进行实验，以菌体量、光密度为指标研究各因素对菌体生长的影响及其最适水平。

1.2.3 正交试验

在单因素试验结果基础上，以葡萄糖、酵母膏、磷酸二氢钾及硫酸镁浓度为考察因素，以布拉氏酵母菌体干重（DCW）为考察指标，进行L16（44）正交试验，研究各因素对酵母生长的影响[13]，因素水平表如表1所示，共16个实验组。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 培养条件对酵母生长的影响

在正交试验结果基础上，研究接种量和培养基初始pH对酵母生物量的影响，实验步骤同1.2.1。

2 结果与讨论

2.1 布拉氏酵母生长曲线

利用Bioscreen全自动生长曲线测定仪绘制布拉氏酵母生长曲线[14]，结果如图1所示，接种后0～4 h处于延滞期，4 h～24 h为对数生长期，24 h之后进入稳定期。因此试验过程中种子液的培养时间选择对数期12 h，发酵培养时间 24 h[15]。

2.2 培养基组成对布拉氏酵母生长的影响

2.2.1 碳源种类对酵母生长的影响

试验结果如图2所示，以麦芽糖为碳源时酵母生物量最高，比葡萄糖组高9.4%；乳糖组生物量最低，其原因可能在于布拉氏酵母菌降解或发酵乳糖的能力较差[14]。鉴于蔗糖成本高于葡萄糖，而且葡萄糖是最容易利用的碳源之一[15]，因此综合考虑，选择葡萄糖为碳源较为适宜。

图1 布拉氏酵母生长曲线Fig.1 Growth curve of Saccharomyces boulardii

图2 碳源种类对布拉氏酵母生物量的影响Fig.2 Effect of carbon sources on the biomass

2.2.2 氮源种类对酵母生长的影响

氮源种类对布拉氏酵母生长的影响见图3。

图3 氮源种类对布拉氏酵母生物量的影响Fig.3 Effect of nitrogen sources on biomass

无机氮源对布拉氏酵母生物量的影响相差不大，菌体量都很低，耗糖很少；而有机氮源组的生物量比无机氮源组高出三倍以上，葡萄糖几乎全部耗完，其中以酵母膏的效果最好，其原因在于酵母膏含丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸以及维生素、生长因子等[15]，因此它能够使布拉氏酵母迅速繁殖，后续试验选择酵母膏为培养基氮源。

2.2.3 磷酸二氢钾浓度对酵母生长的影响

磷是蛋白质和核酸的必要成分，也是三磷酸腺苷ATP的组成成分，因此磷元素的含量对微生物的生长也有一定影响[15]。试验结果如图4，磷酸二氢钾浓度为0.8 g/L时，酵母生物量最大，之后随浓度上升生物量开始降低。

图4 磷酸二氢钾浓度对布拉氏酵母生物量的影响Fig.4 Effect of Potassium Phosphate Monobasic concentration on the biomass

2.2.4 硫酸镁浓度对酵母生长的影响

镁处于离子状态时，是许多重要酶的激活剂，也是发酵过程中不可缺少的成分[15]。硫酸镁浓度对布拉氏酵母生物量的影响如图5。

图5 硫酸镁浓度对布拉氏酵母生物量的影响Fig.5 The effect of magnesium sulfate heptahydrate concentration on the biomass

由图5所示，添加镁离子对布拉氏酵母的生长有一定的促进作用，当其浓度为0.05%时，菌体生物量最大，因此初步确定培养基中硫酸镁浓度为0.5 g/L。

2.3 正交试验结果

正交试验结果如表2。四个影响因素对布拉氏酵母生物量的影响大小顺序为A＞B＞D＞C，即葡萄糖浓度的高低是布拉氏酵母生长最重要的调控因子[17]，硫酸镁浓度影响最小。

发酵培养基的方差分析见表3，结果表明，四个影响因素中，葡萄糖和酵母膏浓度对布拉氏酵母生物量均有显著性影响。综合表2和表3确定培养基的优方案为A4B3C2D2，即布拉氏酵母培养基组成为葡萄糖45g/L，酵母膏12 g/L，磷酸二氢钾0.8 g/L和硫酸镁0.5 g/L，此时布拉氏酵母菌体干重为6.3 g/L。

表2 L16（44）正交试验结果分析Table 2The results and analysis of the L16（44）orthogonal test

表3 发酵培养基的方差分析表Table 3 Variance analysis of fermentation media

2.4 培养条件对酵母生长的影响

2.4.1 pH对酵母生长的影响

培养基的pH会影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的分泌，还会影响培养基中某些营养物质的分解[15]，因此pH是影响微生物生长极为重要的环境因子。图6显示，发酵培养基初始pH5.5时酵母生物量最大，pH偏高或偏低均不利于布拉氏酵母的生长。

2.4.2 接种量对酵母生长的影响

图6 培养基初始pH对菌体生长的影响Fig.6 The effect of initial pH on the biomass of S.boulardii

图7 接种量对菌体生长的影响Fig.7 The effect of incubation size on the biomass of S.boulardii

接种量对酵母生长的影响由图7所示，种子液接种量为9%时生物量达到最大值，增大或减小接种量其生物量均有所降低。研究表明，接种量过多，培养液黏度增加，造成溶氧不足，反而会影响菌体生长；接种量过小则会延长发酵周期，并且容易染菌[15]。因此培养过程取接种量为9%，在此条件下培养布拉氏酵母24 h后其细胞干重为6.5 g/L。

3 结论

本研究确定了摇瓶培养布拉氏酵母的培养条件为葡萄糖45 g/L，酵母膏12 g/L，磷酸二氢钾0.8 g/L，硫酸镁0.5 g/L，初始pH5.5，接种量9%。在此条件下，30℃，200 r/min振荡培养24 h后细胞干重达到6.5 g/L，对于益生菌布拉氏酵母在畜牧业、医药等领域的应用具有实际意义。

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