不同浓度虫茶对MC F-7人乳腺癌细胞的体外抗癌效果

张静，赵欣

（1.重庆市肿瘤医院妇瘤科，重庆400030；2.重庆第二师范学院生物与化学工程系，重庆400067）

虫茶是一种主产于我国的不属于普通茶叶的范畴，但却以保健茶或药用茶的形式出现的以昆虫食叶后排泄的虫粪粒泡制的奇特茶饮料[1]。生产虫茶的昆虫已知有夜蛾科弓须亥夜蛾Hydrillodes morosa Butler.（化香夜蛾、黄纹淡黑夜蛾）与雪疽夜蛾Nodaria niphona Butler.；螟蛾科米缟螟Aglossa dimidiata Haworth.（米黑虫），黄条谷螟Herculia glaucinalis L.（谷粗喙螟），白条谷螟Fujimacia bicoloralis Leech.，均是以幼虫取食苦藤茶、苦丁茶、化香树、大百解、三叶海棠等植物的叶片后，排泄的虫粪，收集加工即成为虫茶产品[2]。其中贵州产虫茶除了遍销全国还远销东南亚，贵州产虫茶主要是米缟螟弓须亥夜蛾等昆虫幼虫啃食樟科润楠属的川黔润楠（Machilus chuanchienensis S.Lee.）腐熟幼嫩叶片后经由昆虫体内特殊代谢排出粪粒晒干制成[3]。

虫茶作为传统饮品和中药，具有清热、去暑、解毒、健胃、助消化等功效，对腹泻、鼻衄、牙龈出血和痔出血均有较好疗效，是一种很好的医药保健饮料[4]。虫茶中含有 K、Mg、Ca、Na、Fe、Mn、Zn 等共 17 种矿物质元素，其中约有10种元素为人体必需微量元素，且Fe、Zn、Ca、Mg等元素含量较高，优于一些名优茶[5]。此外，不同虫茶中还富含有粗蛋白、粗纤维、脂肪、茶多酚、咖啡碱、糖分、维生素和氨基酸[6-7]。近年关于茶叶在抗癌方面的研究已经全免展开，其中类茶类茶饮料的抗癌研究也获得了初步结果。关于虫茶的抗癌效果还没有开展，为了验证虫茶的体外抗乳腺癌效果，本研究初步对贵州出产虫茶进行了MCF-7人乳腺癌细胞体外抗癌功能性的研究。

1 材料与方法

1.1 样品

虫茶：市售原产贵州虫茶，进行冷冻干燥后用沸水3次提取后蒸干后得到水提物，将提取物用二甲基亚砜（DMSO）溶解后待用。

1.2 癌细胞株

MCF-7人乳腺癌细胞（MCF-7 human breast adenocarcinoma cells）购自ATCC（美国典型培养物保藏中心，美国）。

1.3 试剂

DMSO为日本纯正化学株式会社产品，D-Biotin、L-histidine·HCI（monohydrate）、D-glucose-6-phosphate（mono sodium salt）、NADP （sodium salt）、Paraformaldehyde、4，6-diamidino-2-phenylindole、ethidium bromide均购自美国Sigma公司；RPMI 1640培养液、Fetal b ovine serum（FBS）、0.05%trypsin-0.02%EDTA、100unit/mL Penicillin-Streptomycin均购自美国GIBCO公司。Trizol reagent购自美国Invitrogen公司，蛋白检测试剂盒购自美国Bio-Rad公司，western抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.4 仪器与设备

R-114旋转蒸发仪：瑞士Buchi公司；VS-15CFN冷冻离心机：韩国Vision科学株式会社；MC096二氧化碳培养箱：日本三洋电机株式会社；HB-402V超净工作台、HB-205SW恒温水浴震荡器：韩国Hanbeak科学株式会社；PM-1OAK倒置显微镜、BXS0荧光显微镜：日本奥林巴斯株式会社；Elx800酶标仪：美国Bio Tekinstruments公司。

1.5 方法

1.5.1 MTT法癌细胞体外增殖抑制试验

将MCF-7人乳腺癌细胞接种于含10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养液中，在5%CO2、37℃充分湿化条件下的培养箱中培养，每周更换2～3次培养基，6 d～7 d传代一次。将培养的癌细胞按1×104个/mL接种于96孔培养板，每孔 180 μL。5%CO2、37℃充分湿化条件下培养24 h。细胞贴壁后按每孔20 μL加入样品。孔内试验时，每个样品设3个剂量组，分别为50、100、200 μg/mL。48 h 培养后，每孔加入 20 μL MTT 试剂（质量浓度为5 mg/mL）继续培养4 h，结束培养后吸弃孔内上清液后，按每孔150 μL加入DMSO后震荡30 min，540 nm波长下用酶标仪测定各孔OD值并计算细胞增殖抑制率。抑制率=[（空白孔OD值-样品孔OD 值）/空白孔 OD 值]×100%[8]。

1.5.2 DAPI荧光染色的癌细胞凋亡观察

经样品处理后的癌细胞用PBS洗后用3.7%的多聚甲醛（Paraformaldehyde）常温下固定细胞10 min，然后用荧光染料 4，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）溶液染色10 min。用PBS溶液漂洗染色后的细胞2次，荧光显微镜下进行形态学观察并拍照[9]。

1.5.3 Reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）分析

同等条件下用RNAzol试剂制备MCF-7人乳腺癌细胞总RNA。定量分离到RNA后，以oligo dT为引物，在AMV逆转录酶作用下制备ss cDNA，然后以该cDNA为模板，RT-PCR 法扩增 Bax，Bcl-2，caspase-3，9基因（表1）。持家基因glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase（GAPDH）作为内参照。实验结束后，以1%琼脂电泳（含浓度溴化乙锭）检查PCR扩增产物[10]。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Primers of RT-PCR

1.5.4 Western blot分析

用RIPA细胞裂解液裂解细胞后，分离上清，用蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度。取30 μg～50 μg蛋白进行SDS-PAGE分离，电印迹至硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜上。将印迹的NC膜依次进行封闭、与第一抗体、第二抗体结合，抗体结合区带用化学发光法检测[11]。

2 结果与分析

2.1 虫茶的体外抗癌作用试验效果

采用MTT法，检测虫茶的体外抗癌效果。结果显示，虫茶水提取物对MCF-7人乳腺癌细胞具有一定的抑制作用，且抑制效果随样品质量浓度增加而增加。以200 μg/mL浓度处理MCF-7人乳腺癌细胞时，表现出很强的抑制率（78%）。以100、50 μg/mL浓度处理M CF-7人乳腺癌细胞时，癌细胞生长抑制率分别为43%和11%（表2）。由此可见，虫茶对MCF-7人乳腺癌细胞具有增殖抑制效果，浓度较高时抑制效果更显著。

表2 MTT法测定虫茶对MCF-7人乳腺癌细胞的生长抑制效果Table 2 Inhibition of the growth of MCF-7 human breast adenocarcinoma cells by sandy tea as evaluated by MTT assay

2.2 虫茶诱发癌细胞凋亡的效果

DAPI染色后，凋亡细胞核能发出蓝色荧光，通过观察细胞着色情况我们即可判定细胞是否凋亡。对照组MCF-7人乳腺癌细胞染色后细胞核边缘清晰，着色均匀。经虫茶水提取物不同浓度（200、100、50 μg/mL）处理后的MCF-7人乳腺癌细胞均出现了细胞边缘不规则、细胞核浓染、凋亡小体等典型的细胞凋亡现象，而其中以200 μg/mL浓度作用下表现的更为明显，见图1。

图1 经虫茶处理后MCF-7人乳腺癌细胞的细胞凋亡情况Fig.1 Appearance of apoptotic body in MCF-7 human breast adenocarcinoma cells treated with sandy tea

可见虫茶对诱导癌细胞凋亡具有很强的作用，且以200 μg/mL浓度的作用效果明显。

2.3 虫茶叶对Bax，Bcl-2和caspases基因的mRNA和蛋白质表达影响

虫茶水提取物以不同浓度处理MCF-7人乳腺癌细胞，以200 μg/mL浓度处理过的MCF-7人乳腺癌细胞Bax，caspase-3和caspase-9表达最强，以100和50 μg/mL质量浓度处理过的MCF-7人乳腺癌细胞中Bax，caspase-3和caspase-9表达呈现递减的趋势；Bal-2的mRNA表达中，经不同质量浓度样品处理后，随着浓度的升高表达减弱。由此可以看出，在200μg/mL质量浓度处理下虫茶对MCF-7人乳腺癌细胞的凋亡作用强于其他浓度（图2）。

图2 经虫茶处理后MCF-7人乳腺癌细胞的Bax，Bcl-2和caspases的mRNA和蛋白质表达Fig.2 Effects of sandy tea on the mRNA and protein expression of Bax，Bcl-2 and caspases in MCF-7 human breast adenocarcinoma cells

3 讨论

虫茶作为一种保健茶叶饮品，其部分功能性已经得到证实。乳腺癌是女性排名第一的常见恶性肿瘤，除了医学的治疗手段外，通过坚持食用保健食品可以预防和帮助治疗乳腺癌已经得到证实[12]。对癌细胞增值的体外作用可以从一定程度上证明保健食品的癌预防效果。本文中随着虫茶样品浓度的增加MCF-7人乳腺癌细胞的增值减少，证明虫茶可以明显的在体外抑制癌细胞的生长。细胞凋亡是在生理或病理条件下，由基因调控的细胞主动程序化死亡过程。在癌症发生过程中凋亡相关基因的突变或表达异常可以阻断癌细胞的凋亡，促使癌症发生[13]。Bcl-2基因是一种原癌基因，它具有抑制凋亡的作用。Bcl-2可与促凋亡Bax形成二聚体，Bax相对量高于Bcl-2时，Bax同二聚体的数量增多，从而促进细胞死亡[14]。本研究中随着处理癌细胞的虫茶浓度的增加，癌细胞的Bax表达加强，Bcl表达减弱，可以认为虫茶可以促进癌细胞的凋亡，从而起到对乳腺癌的预防作用。Caspase基因选择性地切割某些蛋白质，从而造成细胞凋亡，caspase-9为凋亡途径的上游caspase，caspase-3为下游caspase，caspase-9作为启动性caspase，随着表达的加强可以加强对下游caspase-3的激活，caspase-3可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡[15]。由此可以看出虫茶对癌细胞的caspase-3和9的作用可促进癌细胞凋亡。本文以贵州虫茶为基准进行了体外抗癌效能比较实验，得出虫茶具有很强的体外抗癌效果的结果。虫茶对动物的抗癌效果和对人体的临床作用也有待更深层次的研究。

[1] 励建荣,周李婷.中国虫茶现状及其研究开发思路[J].农产品加工·学刊,2005,34(3)：4-7

[2] 蒋三俊.中国虫茶资源及其保健功用[J].特种经济动植物,2000,3(5)：36

[3] 杨立昌,乙引,秦樊鑫,等.贵州省不同产地虫茶重金属元素含量的测定[J].江苏农业科学,2000,39(4)：392-393

[4] 李时珍.本草纲目：下册[M].哈尔滨：北方文艺出版社,2007：2215

[5]杨立昌,乙引.虫茶资源开发研究进展[J].食品工业科技学,2011,32(8)：470-472

[6] 许乾丽,茅向军,周雪松.老鹰茶和虫茶的6种生命元素分布状态和存在形态研究[J].贵州科学,1999,17(2)：140-143

[7] 郭时印,许伍霞,文礼章,等.三叶虫茶营养成分的分析与评价[J].昆虫知识,2008,45(1)：128-132

[8]SKEHAN P,STORENG R,MONKS SA,et al．New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening[J]．Journal of the National Cancer Institute,1990,82(13)：1107-1112

[9] 赵欣.黄茶的HT-29人体结肠癌细胞的体外抗癌效果[J].北京联合大学学报：自然科学版,2009,23(3)：11-13

[10]ZHAO X,KIM SH,QI YC,et al．Effects of different kinds of salt in comutagenicity and growth of cancer cells[J].Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition,2012,41(1)：26-32

[11]KIM YA,RHEE SH,PARK KY,et al．Antiproliferative effect of resveratrol in human prostate carcinoma cells[J].Journal of Medicinal Food,2003,6(4)：273-280

[12]齐秀英,张安玉,武光林,等.饮食与乳腺癌发病关系的探讨[J].营养学报,1990,12(3)：221-227

[13]徐立红.细胞凋亡相关的组合生物标志物的分子基础及其在环境毒理学中的意义[J].水生生物学报,2005,29(3)：329-335

[14]DELIC R,S姚TEFANOVIC M．Optimal laboratory panel for predicting preeclampsia[J].Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine,2010,23(1)：96-102

[15]BLANC C,DEVERAUX QL,KRAJEWSKI S,et al．Caspase-3 is essential for procaspase-9 processing and cisplatin-induced apoptosis of MCF-7 breast cancer cells[J].Cancer Research,2000,60(16)：4386-4390