大鼠脑出血后血肿周围组织中p75NTR、TrkA的表达及其与细胞凋亡的关系

陕西省新安中心医院内科（西安710048） 鲍 昕 王 宁 李传坤 徐高峰 鲍 刚

脑出血（Cerebral hemorrhage，CH）是一种临床常见的神经系统疾病，具有很高的致死率和致残率。我国每年约有140余万人发生急性脑出血，其病死率约为40%～60%，存活者中留有病残的约70%～80%，其中40%遗留严重残疾［1］，严重威胁到患者的生命及生存质量。研究证实：脑出血后一段时间内存在的细胞凋亡为脑出血后继发性损伤的一种，延续和加重了脑出血病情的发展，对患者的预后带来了不利的影响［2］。

本研究采用立体定向脑内注射法制备脑出血动物模型，检测脑出血后血肿周围组织中的凋亡细胞比例以及p75NTR、TrkA的蛋白及RNA表达水平，用以探讨p75NTR、TrkA的表达与脑出血后细胞凋亡的关系，以期阐明p75NTR、TrkA在脑出血后细胞的凋亡中所发挥的作用。

材料与方法

1 动物与分组 SD雄性大鼠50只，体重230～250g，由西安交通大学实验动物中心提供。将其随机分为5组，每组10只，其中4组为实验组（即ICH组），1组为对照组（即假手术组）。实验组按脑出血后处死时间分为6h组、24h组、72h组及10d组，对照组在假手术后10d处死。

2 器材与试剂 ①主要实验器材：动物立体定向仪，流式细胞仪，显微照相系统，BIO－RAD荧光定量PCR仪。②主要实验试剂：兔抗鼠p75NTR抗体、兔抗鼠TrkA抗体购自北京博奥森生物技术公司；DAB酶底物显色试剂盒、即用型SP系列检测试剂盒购自北京中杉生物技术公司。RNA提取试剂盒Fast200购自飞捷生物公司；逆转录试剂盒购自美国Fermentas公司；荧光定量PCR试剂盒购自美国Bioer公司；p75NTR、TrkA引物及内参β－actin由北京三博远志生物技术有限责任公司提供，p75NTR的序列：上游 引 物 P1：5’－CCTCATTCCTGTCTATTGCTCCATC－3’，下 游 引 物 P2：5’－TTCCTCACCTCCTCACGCTTGG－3’，TrkA 的序列：上游引物 P1：5’－AGGTGGCTGCTGGTATGGTG－3’，下 游 引 物 P2：5’－GTGCTGAACTTGCGGTAGAGG－3’，β－actin的序列：上游引物 P1：5’－CTATCGGCAATGAGCGGTTCC－3’，下 游 引 物 P2：5’－TGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG－3’。

3 脑出血动物模型建立及标本制作 使用立体定向仪，于大鼠尾状核头的体表投影处用钻孔，采用大鼠尾部自体血约80μl，用微量注射器缓慢匀速地推进右侧尾状核头（对照组只插入针头不注血）。分别于建模后6h，24h，72h，10d四个时间点处死实验组大鼠，对照组于假手术后10d处死。以穿刺针道为中心，取血肿周围（对照组取穿刺到周围）5mm以内的脑组织备用。

4 流式细胞仪检测凋亡百分比 将组织块剪碎后缓慢吹打至匀浆状，过滤，收集滤液，4℃、1000rpm，离心5mins，弃上清，重悬于磷酸盐缓冲溶液（4℃），再次离心（4℃、1000rpm）5mins，重悬；取1～5×105细胞悬液，1000rpm，离心5mins后弃上清重悬于500μl的结合缓冲液（4℃）中，依次加入5μl异硫氰酸荧光素及10μl碘化丙稀，轻摇混匀，室温下避光反应15min后直接上机检测。

5 免疫组化 采用S－P法，步骤严格按照试剂盒说明书进行，所有标本均在同一条件下采用过氧化物酶标记的链霉卵白素法进行免疫组织化学染色，各步骤间均用磷酸盐缓冲液冲洗，并用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照，DAB显色，苏木素复染。

6 Real－time PCR检测p75NTR、TrkA 基因表达 在无菌条件下，从液氮罐中取出脑组织，按照各实验分组相应的时间点行RT－PCR分析，按RNA提取试剂盒Fast 200说明提取组织总RNA，采用Fermentas逆转录试剂盒按操作说明逆转录生成cDNA，产物进行荧光定量PCR。

7 统计学处理 本研究对所得数据用SPSS17．0统计软件包进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，以P＜0．05为有显著性差异，P＜0．01为有极显著性差异。

结 果

1 血肿周围组织中的细胞凋亡情况 见表1。ICH6h后细胞凋亡率显著上升，72h达到高峰，10d组细胞凋亡率有所下降，各实验组分别与对照组进行比较均存在极显著性差异（P＜0．01）。

表1 各组细胞凋亡率［（±s）%］

表1 各组细胞凋亡率［（±s）%］

组别 n 凋亡细胞百分率P 10 13．34±2．51 0．001 ICH24h组 10 20．50±2．14 0．000 ICH72h组 10 37．76±4．05 0．000 ICH10d组 10 30．03±3．69 0．000对照组ICH6h组10 8．37±3．13

2 血肿周围组织中p75NTR、TrkA的蛋白表达情况及其与细胞凋亡的关系

2．1 免疫组化半定量分析结果：见表2。各实验组中p75NTR蛋白阳性表达率分别与对照组进行比较均存在极显著性差异（P＜0．01），p75NTR蛋白阳性表达率在ICH6h后显著上升，72h达到高峰，10d有所下降；TrkA蛋白阳性表达率6h组及24h组与对照组比较无显著性差异（P＞0．05）；72h组及10d组与对照组比较存在显著性差异（P＜0．05）。

2．2 各蛋白的表达与细胞凋亡的关系：p75NTR的阳性表达率与细胞凋亡率的变化趋势完全一致，二者之间呈极强正相关（r＝0．855，P＝0．000）；TrkA的阳性表达率与细胞凋亡率的变化趋势在72h前无明显关系，72h后则相反，二者之间呈弱正相关（r＝0．399，P＝0．004）。

表2 免疫组化半定量分析结果（±s）%

表2 免疫组化半定量分析结果（±s）%

注：与对照组相比，＊P＝0．000；＃P＝0．558；△P＝0．662；P＝0．001；☆P＝0．001

阳性表达率6h组 10 31．31±3．65＊ 31．64±5．61组别 n p75NTR阳性表达率 TrkA＃30．39±3．95 24h组 10 44．19±6．53＊ 30．19±5．51△72h组 10 55．60±6．42＊ 36．79±3．17☆10d组 10 46．15±6．60＊ 41．60±4．23＊对照组 10 18．55±2．4＊

3 血肿周围组织中p75NTR、TrkA的RNA表达情况及其与细胞凋亡的关系

3．1 RT－PCR结果：见表3。各实验组分别与对照组间进行比较，p75NTR的RNA相对表达量均存在极显著性差异（P＜0．01），p75NTR基因的相对表达量在ICH6h后显著上升，72h达到高峰，10d有所下降；TrkA基因的相对表达量6h组及24h组与对照组比较无显著性差异（P＞0．05）；72h组及10d组与对照组比较存在极显著性差异（P＜0．01）。

表3 各基因的相对表达量分析结果（±s）

表3 各基因的相对表达量分析结果（±s）

注：与对照组相比，＊P＝0．028；＃P＝0．000；△P＝0．856；☆P＝0．727

基因表达量6h组 10 1．17±0．29＊ 1．87±0．723组别 n p75NTR基因表达量 TrkA△10 0．83±0．35 1．82±0．42 24h组 10 2．36±0．70＃ 1．75±0．57☆72h组 10 5．04±1．52＃ 3．02±0．77＃10d组 10 4．39±1．50＃ 3．66±0．59＃对照组

3．2 各基因的表达与细胞凋亡的关系：p75NTR基因的相对表达量与细胞凋亡率的变化趋势完全一致，两者之间呈极强正相关（r＝0．816，P＝0．000）；TrkA基因的相对表达量与细胞凋亡率的变化趋势在72h前无明显关系，72h后则相反，两者之间呈中等程度正相关（r＝0．595，P＝0．000）。

讨 论

细胞凋亡是脑出血后血肿周围组织中细胞死亡的主要形式［3］。Qureshi等［4］发现出血24h内即可检测到凋亡细胞，5d时仍有凋亡细胞的存在，凋亡细胞占血肿周围死亡细胞的50%以上；我们之前的研究［5］发现血肿周围组织中凋亡细胞率明显高于血肿远隔部位组织。

p75NTR是一个分子量为75kD的单链跨膜I型糖蛋白，总长有427个氨基酸，是一种神经营养素（Neurotrophins，NTs）受体，其在中枢神经系统发育阶段存在着广泛的表达。近年来的研究显示：p75NTR在神经细胞凋亡过程中具有促进作用。研究证实：p75NTR可使体外培养的感觉神经元、交感神经元、雪旺细胞及运动神经元发生凋亡，下调或者阻断p75NTR的表达可以减少其凋亡；在一些中枢神经系统疾病中，神经元的凋亡也与p75NTR有关，如在肌萎缩侧索硬化、Alzheimer’s症、脊髓损伤、脑损伤中，均存 在 p75NTR 表 达 的 增 加［6］。本 研 究 发 现：p75NTR表达的动态变化趋势与细胞凋亡率完全一致，两者之间呈极强正相关，这提示p75NTR在脑出血后的细胞凋亡过程中发挥着积极作用。

TrkA受体作为NGF的高亲和力受体，具有神经保护作用，Hempstead等［12］：发现 NGF可以高亲和力与TrkA结合从而维持细胞的存活及神经元轴突的生长；TrkA受体的激活能够对星形孢菌素（STS）诱导的海马细胞的凋亡起保护作用，而使用K252a抑制TrkA受体后保护作用消失；Lu等发现NGF诱导的TrkA的活化能够介导神经细胞的生存，而应用TrkA的拮抗剂K252a则能阻断其神经保护作用；Bai等发现在视网膜损伤后TrkA的表达上调，TrkA受体被NGF激活后可起神经保护作用。然而，p75NTR除了有诱导细胞凋亡的作用外，还能与TrkA受体协作提高NGF与TrkA的亲和力，促进细胞存活和分化［7～9］。本研究结果显示：TrkA受体的表达水平在脑出血后有不同程度的增加，在脑出血后72h内，TrkA受体的表达是有一定程度的上调，但与对照组相比无显著性差异，而此时处于上升趋势，而在72h以后，TrkA受体水平继续上调，与对照组相比有显著性差异，细胞凋亡也在72h后出现下降趋势，提示在72h前，TrkA受体的表达水平上调缓慢不足以拮抗p75NTR诱导的凋亡，随后其表达明显上调，逐渐发挥出其神经保护作用，从而使细胞凋亡得以降低。

脑出血后的细胞凋亡调控机制极其复杂，其过程可能涉及到多种相关基因及蛋白，目前凋亡抑制剂在脑出血治疗方面的研究已进入动物实验阶段，TNF－α，caspase－3，MMP－12是当前脑出血后细胞凋亡通路中研究较多的靶点，这些研究结果显示，部分凋亡抑制剂能够改善脑出血后的细胞凋亡，从而减轻由细胞凋亡引起的脑出血后继发性损伤。随着研究的不断深入，p75NTR、TrkA在脑出血后细胞凋亡过程中的作用机制将被进一步阐明，这可为脑出血后的神经保护及治疗提供新思路及新途径。

［1］ Riggs JE，Libell DP，Brooks CE，et al．Impact of institution of a stroke program upon referral bias at a rural ac－ademic medical center［J］．The Journal of Rural Health，2005，21（3）：269－271．

［2］ 张 云，刘 斌．脑出血后继发性脑损伤的细胞凋亡机制研究进展［J］．中国康复医学杂志，2007，22（12）：1130－1133．

［3］ Sukumari－Ramesh S，Laird MD，Singh N，et al．Astrocyte－derived glutathione attenuates hemin－induced apoptosis in cerebral microvascular cells［J］．Glia，2010，58（15）：1858－1870．

［4］ Quershi AI，Shuri MF，Ostrow PT，et al．Apoptosis as a form of cell death in intracerebral hemorrhage［J］．Neurosurgery，2003，52（5）：1041－1048．

［5］ 鲍 刚，王茂德，韩玉梁．脑出血血肿周围组织中p75NTR和ProNGF的表达及其与细胞凋亡的关系［J］．神经解剖学杂志，2010，26（1）：78－81．

［6］ Nykjaer A，Willnow TE，Petersen CM．p75NTR－－live or let die［J］．Curr Opin Neurobiol，2005，15（1）：49－57．

［7］ Nguyen TL，Kim CK，Cho JH，et al．Neuroprotection signaling pathway of nerve growth factor and brain－derived neurotrophic factor against staurosporine induced apoptosis in hippocampal H19－7cells［J］．Exp Mol Med，2010，42（8）：583－595．

［8］ Lu J， Wu DM， Hu B，et al．NGF－Dependent activation of TrkA pathway：A mechanism for the neuroprotective effect of troxerutin in D－galactose－treated mice［J］．Brain Pathol，2010，20（5）：952－965．

［9］ Bai Y，Dergham P，Nedev H，et al．Chronic and acute models of retinal neurodegeneration TrkA activity are neuroprotective whereas p75NTR activity is neurotoxic through a paracrine mechanism［J］．J Biol Chem，2010，285（50）：39392－39400．