阿霉素诱导G-四联体形成对SW 480细胞端粒酶活性的影响

孙 彦，孟永亮(山东万杰医学院医学系内科学教研室，淄博 255213)

端粒是真核生物细胞染色体末端的一个特殊结构，与细胞生长、增殖、衰老，肿瘤发生等密切相关。端粒组分包括长5-20 kb的双链重复序列(TTAGGG)n，一条3’富含G的单链悬突(G尾)和端粒结合蛋白［1］。端粒3’末端单链悬突可形成四链状DNA结构，即鸟嘌呤-四链体(guanine-quadruplex，G4)。G4在端粒酶催化的端粒延伸反应过程中的重要调节作用已受到人们的重视，能够特异作用于G4的小分子化合物对靶向端粒的肿瘤治疗有重要意义［2-4］。研究［5］发现，某些蒽醌类化合物具有诱导G4形成和稳定G4结构的作用，而且在一些肿瘤细胞株内显示出抑制端粒酶活性及对肿瘤细胞生物学性状产生影响的特性。基于此，本研究选用蒽醌类代表性药物(阿霉素)，观察阿霉素诱导鸟嘌呤四联体形成，并研究其对SW480细胞端粒酶活性的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

阿霉素(大连美仑生物技术有限公司);线性寡核苷 酸 序 列 d(TTAGGG)、d(TTAGGG)2、d(TTAGGG)3、d(TTAGGG)4、d(TTAGGG)5、d(TTGGAG)4、d(TGTAGG)4、d(TAGGTG)4、d(TTGAGG)4(上海生物工程公司合成，广西医科大学肿瘤学实验室保存);端粒酶检测试剂盒(美国罗氏生物公司);MTT(AMRESCO)。

1.2 阿霉素对SW480细胞增殖抑制的影响(MTT法)

取对数生长期的SW480细胞制成5×104细胞悬液，取100 μl接种于96孔培养皿内，向培养孔内加入不同浓度的阿霉素溶液，共分为5组:空白对照组，阿霉素2.5 μg/ml组，阿霉素 5 μg/ml组，阿霉素10 μg/ml组，阿霉素 20 μg/ml组。分别培养24，48，72，96 h 后，每孔加入 MTT 液20 μl，再培养4 h，去上清，每孔加入150 μl DMSO，空白孔用二甲基亚砜调零，酶标仪检测波长490 nm处吸光度OD值。实验重复三次，计算平均值。抑制率=［(对照-空白)-(实验-空白)］/(对照 -空白)×100%，以时间(h)为横坐标，细胞生长抑制率为纵坐标，绘制细胞生长抑制曲线图。

1.3 阿霉素对 SW480细胞端粒酶活性的影响(TRAP法)

常规提取端粒酶，-70℃保存待用，取待测样品 50 μg(总蛋白)，反应体积为 20 μl，其中含引物TS(5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’)及 CX(5’-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3’)，25℃，30 min，PCR 扩增仪。取5 μl扩增产物，加入20 μl变性试剂，25 ℃孵育10 min，再加入225 μl杂交缓冲液，振荡混匀后取100 μl混合物加入已包被微孔板的孔中，37℃，300 r/min振荡2 h，弃去杂交液，缓慢用清洗液冲洗三次，加入抗地高辛复合物工作液100 μl，25 ℃，30 min，再用清洗缓冲液洗5 次，加入 TMB 底物溶液 100 μl，20 min 后再加入 100 μl终止液终止反应。用酶标仪测定A450nm和A630nm的吸光度值(A值)。

阳性结果判断:阳性对照为SW480细胞，阴性标本经65℃，加热30 min灭活端粒酶后作为阴性对照。阳性对照吸光度应大于1.5，阴性对照吸光度应小于0.25，待测标本ΔA=标本吸光度A值-阴性对照吸光度A值，若标本ΔA＞0.2，即为端粒酶阳性。

1.4 阿霉素对鸟嘌呤四联体结构及其相似物的影响

通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测不同浓度阿霉素对端粒重复序列d(TTAGGG)4电泳迁移速度的影响。在24℃条件下，将5 nmol d(TTAGGG)4与10 μl反应缓冲液充分混合，孵育13 min，加入不同浓度阿霉素，共分为四组(0，1.25，2.5，5 μg/ml)，孵育3 h，加入4 μl反应缓冲液，在4 ℃条件下行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度12%，电泳时间30 min。检测5 μg/ml阿霉素对不同端粒重复序列 d(TTAGGG)、d(TTAGGG)2、d(TTAGGG)3、d(TTAGGG)4、d(TTAGGG)5电泳迁移速度的影响。检测 5 μg/ml阿霉素对端粒重复序列d(TTAGGG)4及其类似物 d(TTGGAG)4、d(TGTAGG)4、d(TAGGTG)4、d(TTGAGG)4 电泳迁移速度的影响。

1.5 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析。计量资料以±s表示，多样本均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齐采用LSD法检验并进行两两组间比较，方差不齐采用Dunnett’s法检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 阿霉素对SW480细胞增殖抑制的影响

MTT结果显示，阿霉素对SW480细胞增殖有抑制作用，与药物浓度和培养时间有关，药物浓度越大，培养时间越长，抑制细胞增殖越明显(见图1)，2.5 μg/ml和 5 μg/ml的阿霉素培养 48 h 时，细胞的增殖抑制率 ＜ 50%，10 μmol/L、20 μmol/L 的阿霉素，细胞增殖抑制率＞50%;而5 μg/ml阿霉素培养72 h时，细胞增殖抑制率＞50%。跟据亚细胞毒理论，选择抑制率在50%以下的最小浓度作为后续实验的阿霉素浓度。据此，选用2.5 μmol/L的阿霉素作为后续研究浓度，培养48 h。

图1 不同浓度阿霉素不同时间对SW480细胞生长抑制的影响Figure 1 Effect of adriamycin on SW480 cell growth

2.2 阿霉素对SW480细胞端粒酶活性的影响

不同浓度阿霉素作用于SW480细胞48 h后，随着浓度的增加，端粒酶活性逐步减弱，与空白对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05，见图2)。

2.3 阿霉素对鸟嘌呤四联体结构及其相似物的影响

在不同阿霉素浓度下，端粒重复序列d(TTAGGG)4迁移速度不同，随着阿霉素浓度的增加，电泳迁移速度逐渐加快;无阿霉素作用时，电泳迁移较慢;1.25，2.5 μg/ml阿霉素作用时，电泳迁移速度加快，但存在部分拖尾现象，表明低浓度阿霉素作用时，四联体结构形成较慢;当5μg/ml阿霉素作用时，电泳迁移速度增快，条带变得清晰、完整，无拖尾现象(见图3)。

图2 不同浓度阿霉素作用48 h后SW480细胞端粒酶活性比较Figure 2 Comparison of telomerase activity of SW480 cells after treated with different concentrations of adriamycin for 48 h

图3 不同浓度阿霉素对d(TTAGGG)4电泳迁移速度的影响Figure 3 Effect of different concentrations of adriamycin on electrophoretic migration speed of d(TTAGGG)4

5 μg/ml阿霉素可使端粒序列重复4次以上的迁移速度加快，对端粒序列重复4次以下的迁移速度无影响(见图4)。

5 μg/ml阿霉素对端粒重复序列d(TTAGGG)4及其类似物电泳迁移速度的影响:d(TTAGGG)4的电泳迁移速度显著快于核苷酸序列分子量和所带电荷相同的类似物 d(TTGGAG)4、d(TGTAGG)4、d(TAGGTG)4、d(TTGAGG)4、d(TTAGGG)4，表明GGG串联区是阿霉素诱导形成紧凑二级结构的重要前提条件，导致迁移速度加快(见图5)。

3 讨论

图4 5 μg/ml阿霉素对端粒序列不同重复次数电泳迁移速度的影响Figure 4 Effect of 5 μg/ml adriamycin on electrophoretic migration speed of different telomere repeat sequences

图5 5 μg/ml阿霉素对端粒重复序列d(TTAGGG)4及其相似物电泳迁移速度的影响Figure 5 Effect of 5 μg/ml adriamycin on electrophoretic migration speed of telomere repeat sequence d(TTAGGG)4 and its analogues

肿瘤细胞是在端粒酶受到因子激活的状态下，继续延伸端粒，无限制地进行细胞分裂转化而成的［4］。因此，只要抑制肿瘤细胞中的端粒酶活性，便可以达到抗肿瘤的目的。G4是在DNA处于开链状态下，富含G序列的核苷酸以氢键进行碱基配对形成的端粒的特殊二级结构［7］，G4形成可影响端粒酶引起的端粒延长［8］，阻止端粒酶与端粒结合，干扰端粒复制。因此，稳定G4结构可以抑制端粒酶活性。大量的相关研究表明，通过G-四联体特异性配体的稳定作用，导致了端粒酶活性的降低，因而阻止了端粒的延长［9］。研究［10］发现，有多种蒽醌类衍生物可通过插入到含端粒重复序列的寡核苷酸分子中，诱导G4形成并使之稳定;而这些衍生物在充当G4配体时，在某些肿瘤细胞系内会对其端粒酶活性及肿瘤细胞生物学行为产生影响。本研究选用阿霉素作为G4配体，细胞外观察阿霉素诱导鸟嘌呤四联体形成，细胞内研究其对SW480细胞端粒酶活性的影响，初步探讨G-四联体结构的生物学功能和对SW480细胞端粒酶介导端粒延伸反应的影响。

本研究中为避免严重细胞毒作用对SW480细胞端粒酶活性检测的干扰，避免短期凋亡和其他非特异情况发生。首先进行了阿霉素细胞毒性实验，根据MTT结果，确定了作用时间48 h，作用浓度2.5 μmol/L阿霉素作为本研究的细胞内浓度。在TRAP检测中，不同作用浓度的阿霉素对SW480细胞端粒酶活性有明显抑制作用。结合细胞毒性试验，说明2.5 μmol/L阿霉素是较合适的细胞内作用浓度，不会产生过大的细胞毒作用，在抑制SW480细胞增殖的同时，可以对其端粒酶活性产生抑制作用。

本研究发现阿霉素可促使含端粒重复序列的核苷酸形成高度有序的紧凑二级结构，GGG串联是阿霉素诱导紧凑二级结构形成的重要前提条件。端粒序列重复的次数是形成端粒四联体结构的重要因素［11］，4个鸟嘌呤碱基通过Hoogsteen氢键的配对方式循环排列连接而形成G-四联体结构，再通过适当体积的阳离子与鸟嘌呤碱基的负电羰基集团结合，由此形成稳定的二级结构。本研究发现阿霉素可使端粒序列重复4次及以上的含GGG串联区的线性核苷酸结构发生改变，形成紧凑的二级结构，导致迁移速度加快。端粒重复序列小于3次者，无法形成稳定的二级结构，因而电泳迁移条带没有改变。这与胡晓文等［10］采用改良TRAP-G4法检测阿霉素诱导G4形成及其对Tca8113细胞端粒酶介导端粒延伸反应的影响结果一致。本研究结果提示在细胞外，阿霉素可能诱导含端粒重复序列的核苷酸形成G4结构。

本实验结果表明:在细胞内，阿霉素可抑制SW480增殖，抑制端粒酶活性;在细胞外，阿霉素可诱导含端粒重复序列的核苷酸形成G4结构。提示阿霉素在细胞内抑制SW480细胞端粒酶活性与其诱导G4形成有关。本研究设计的端粒序列及其类似物主要是通过化学法合成，与人体内生物条件下存在的端粒序列尚存在许多差异，如何寻找一种较好的能够从SW480细胞中提取端粒结构的方法将是我们进一步研究的内容。

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