肝缺血/再灌注损伤对血浆及下丘脑orexin-A表达的影响

赵 琳，贾鲲鹏，王 璐，刘伯锋，魏晓丽(延安大学医学院解剖教研室，延安 76000;延安大学附属医院儿科;通讯作者，E-mail:jkpzhaolin@63.com)

肝缺血/再灌注 (hepatic ischemia/reperfusion，H-I/R)损伤常见于肝切除、肝移植、休克后复苏等，在损伤过程中机体常出现严重的能量代谢障碍和炎症反应。增食欲素-A(orexin-A)是由下丘脑外侧区(lateral hypothalamus area，LHA)合成和分泌的具有神经兴奋作用的多肽，具有刺激摄食和减少能量消耗的作用。orexin-A参与调控睡眠/觉醒、下丘脑-垂体-甲状腺/肾上腺/性腺轴的激素分泌，并刺激儿茶酚胺合成，并与血清葡萄糖、糖皮质激素、交感神经兴奋性存在一定的联系［1，2］，提示 orexin-A可能参与了创伤应激后内环境紊乱的调控过程，是与创伤应激密切相关的代谢因子。我们采用放射免疫法检测H-I/R损伤后血浆和下丘脑中orexin-A的水平，并采用RT-PCR方法检测下丘脑orexin-A mRNA的表达，探讨H-I/R损伤后orexin-A的表达变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

成年雄性SD大鼠40只，由延安大学医学院实验动物中心提供，体质量250-300 g，随机分为5组，分别为假手术组(sham)、肝缺血1 h后再灌注1 h组(I/R1 h)、肝缺血1 h后再灌注2.5 h组(I/R 2.5 h)、肝缺血1 h后再灌注4 h组(I/R4 h)和肝缺血1 h后再灌注6 h组(I/R6 h)，每组8只。

1.2 动物模型制备

2%异戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉，开腹，从右侧肋缘下做斜切口，充分显露第一肝门，用微血管夹横向夹闭支配肝中叶、左叶的肝蒂左分叉，不阻断支配肝右叶血流的肝蒂右分叉，以防门静脉和胃肠道淤血，阻断血流1 h后取出血管夹进行再灌注，腹腔内注射1 ml生理盐水后逐层关腹。sham组只钝性游离肝蒂左分叉，不进行钳夹肝蒂操作。

1.3 血浆及下丘脑组织样品制备

损伤后相应时间点大鼠心脏取血，加入乙二胺四乙酸(EDTA)和抑肽酶，37℃水浴20 min，3 000×g低温离心20 min，-20℃保存。抽血后立即取出大鼠下丘脑，置液氮速冻后于-80℃保存。称取下丘脑组织200 mg匀浆，加入1 ml预冷生理盐水，20 000 r/min、30 s冰浴匀浆3次。将匀浆液12 000×g离心20 min，保存中层清液-20℃待测。

1.4 放射免疫分析

向离心管中加入orexin-A、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)、Na125I、氯胺 -T 振荡反应 30 s，加偏重亚硫酸钠20 μg终止反应。将终止液缓慢加载于C-25SEP柱上层，磷酸盐缓冲液淋洗，收集洗脱液4℃保存。将200 μl样品与orexin-A抗体、125I-肽涡旋混匀，4℃孵育24 h。再加免疫分离剂500 μl室温反应15 min，4℃、3 000×g离心20 min，弃上清，取沉淀用γ计数仪测定。下丘脑的匀浆液样品用考马斯亮蓝G-250法测定总蛋白，比较1 g匀浆液总蛋白中所含的orexin-A(μg)。

1.5 reverse transcription-PCR(RT-PCR)

orexin-A引物序列:上游 5’-GGACCACTGCACCGAAGA-3’，下游5’-GGTTACCGTTGGCCTGAA-3’，扩增片段324 bp。内参照 β-actin:上游5’-CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC-3’，下游5’-CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG-3’，扩增片段690 bp。上海英骏生物技术有限公司合成。总RNA提取及RT-PCR:将-80℃下保存的下丘脑组织取出后，用Trizol法提取总RNA，依照紫外分光光度计测纯度与浓度，根据说明书进行反转录合成，取cDNA 3 μl用于PCR扩增，反应条件:94℃3 min后94℃40 s，54℃1 min，72℃1 min共35个循环;72℃延伸7 min。用捷达凝胶成像分析系统扫描扩增带，用orexin-A的扩增产物与β-actin扩增产物光密度的比值表示orexin mRNA的相对值。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 H-I/R损伤后血浆及下丘脑orexin-A水平

各再灌注组血浆orexin-A水平与损伤后sham组比较均无显著差异，再灌注组间两两相比，I/R1 h组显著高于I/R6 h组(P＜0.05)。各再灌注组下丘脑匀浆液orexin-A水平与损伤后sham组比较及再灌注组间两两比较，均无显著差异(见表1)。

表1 H-I/R损伤后各组血浆及下丘脑orexin-A水平(±s)Table 1 Changes of orexin-A levels in p lasm a and hypothalamus after H-I/R injury(±s)

表1 H-I/R损伤后各组血浆及下丘脑orexin-A水平(±s)Table 1 Changes of orexin-A levels in p lasm a and hypothalamus after H-I/R injury(±s)

与 I/R6 h组比较，*P＜0.05

组别 血浆orexin-A/(ng/L)下丘脑orexin-A/(μg/g总蛋白)sham组338.62 ±40.02 6.05 ±1.76 I/R1 h 组 356.85 ±28.32* 6.78 ±1.95 I/R2.5 h 组 344.28 ±35.38 4.67 ±1.68 I/R4 h 组 321.09 ±29.59 3.96 ±1.12 I/R6 h组315.04 ±40.12 7.08 ±2.03

2.2 H-I/R损伤后下丘脑orexin mRNA表达

各再灌注组下丘脑orexin-A mRNA的表达水平与损伤后sham组比较，I/R4 h和I/R6 h组显著升高(P＜0.05)。再灌注组之间两两比较，I/R4 h和I/R6h组显著高于 I/R1h组(P＜0.05，见图1)。

图1 H-I/R损伤后下丘脑orexin mRNA表达Figure 1 Expression of orexin-A mRNA in hypothalamus after H-I/R injury

3 讨论

H-I/R损伤是指肝缺血一段时间，当血流重新恢复后，细胞功能代谢障碍及结构破坏反而较缺血时进一步加重，器官功能进一步恶化的临床综合征。在肝门阻断的肝叶切除、肝移植以及休克的复苏等过程中均会不可避免地遭遇H-I/R损伤。再灌注损伤是致手术后肝脏功能衰竭的重要原因之一，是外科治疗、急救医学经常面临的问题，且具有典型的病理生理改变，其损伤机制主要是活性氧生成、Ca2+超载、Kupffer细胞激活和白细胞活化等［3，4］。orexin-A是1998年Sakurai等［5］在实验室寻求已知的七次跨膜“孤儿”受体的内源性配体时发现的，为一种33个氨基酸的多肽，在不同物种之间，其蛋白序列有很大程度的同源性。参与摄食、睡眠与觉醒、能量代谢和内分泌等多种功能的调节，还可能参与创伤、炎症、感染后内环境紊乱的调控过程，与创伤应激密切相关。

本研究结果显示，再灌注各组的血浆orexin-A水平与sham组无显著变化。可能是再灌注早期的高代谢造成动物机体类似饥饿的状态，而此状态会通过神经-内分泌系统上调血浆的orexin-A水平［6］;也可能是因为中性粒细胞释放自由基破坏了蛋白质的结构和活性，抵消了饥饿状态使血浆orexin-A上调的作用。而血浆orexin-A在I/R1 h组显著高于I/R6 h组，提示肝再灌注早期的能量储备不足，随着时间向后推移，高代谢逐渐恢复、自由基释放也逐渐降低，血浆orexin-A水平维持平稳态势，提示它受到机体的宏观调控。下丘脑是orexin-A的核心分泌器官，其orexin-A的表达受血浆水平的反馈调节，整个过程无显著变化。下丘脑orexin mRNA的表达在H-I/R损伤早期受高代谢状态影响，orexin mRNA表达受到抑制，随着高代谢状态逐步恢复，orexin mRNA表达受负反馈影响逐渐回升。提示orexin参与了H-I/R后的能量代谢调控。

H-I/R损伤后血浆和下丘脑中orexin-A的表达水平发生了一定程度变化，说明orexin-A参与了创伤应激后内坏境紊乱的调控过程。深入研究以orexin-A为核心的神经-内分泌网络在创伤、炎症、感染时发挥效应的可能机制，将有助于为H-I/R损伤找到有效可靠的干预手段，减少H-I/R损伤的发生。

［1］Teske JA，Billington CJ，Kotz CM.Neuropeptidergic mediators of spontaneous physical activity and non-exercise activity thermogenesis［J］.Neuroendocrinology，2008，87(2):71-90.

［2］Korczynski W，Ceregrzyn M，Matyjek R，et al.Central and local(enteric)action of orexins［J］.J Physiol Pharmacol，2006，57(Suppl 6):17-42.

［3］何剑戈，任爱红，施懿诚，等.肝缺血再灌注损伤的机制及其预防［J］.河南科技大学学报，2012，30(3):235-237.

［4］Caldwell CC，Tschoep J，Lentsch AB.Lymphocyte function during hepatic ischemia/reperfusion injury［J］.J Leukoc Biol，2007，82(3):457-464.

［5］SakuraiT，Amemiya A，Ishii M，et al.Orexins and orexin receptors:a family of hypothalamic neuropeptides and G protein-coupled receptors that regulate feeding behavior［J］.J Cell，1998，92(4):573-585.

［6］Ouedraogo R，Naslund E，Kirchgessner AL.Glucose regulates the release of orexin-A from the endocrine pancreas［J］.Diabetes，2003，52(1):111-117.