菜蛾斑蝥素受体PP2A 催化亚基基因的原核表达与纯化

郑林青，郝少东，张志勇，王进忠，杨宝东，张民照

(农业应用新技术北京市重点实验室，北京农学院植物科学技术学院，北京 102206)

小菜蛾Plutella xylostella L.是世界性十字花科植物害虫，该虫发生代数多、繁殖速度快、世代重叠严重，是农业生产中重点的防治对象。长久以来，人们主要以施用杀虫剂作为对菜蛾的防治手段，但随着杀虫剂广泛、大量的使用，加上菜蛾生活史的特殊性，目前菜蛾几乎对所有现行杀虫剂都已产生了较高抗药性(冯夏等，2011;刘霞和牛芳，2013)。靶标不敏感是昆虫对杀虫剂产生抗药性的一个极为重要的生化机制(李显春和王荫长，1998)。交替使用不同靶标的农药是克服菜蛾抗药性的重要途径(赵怀玲和尤民生，2001;黄剑和吴文君，2003)。因此，筛选开发具有不同作用机制的新型杀虫剂对于长远地解决菜蛾抗药性问题具有重要意义。

斑蝥素(Cantharidin)是一种广泛存在于鞘翅目芫菁科等昆虫(俗称斑蝥Mylabris phalterata pallas)体内的次生代谢物，具有较高的杀虫活性和广泛的杀虫谱(张志勇等，1996;魏列新等，2007;刘瑞瑞等，2010)，对菜蛾具有触杀，胃毒作用(张志勇等，1998)。斑蝥素被饲喂菜蛾后，其胃毒作用部位是试虫中肠，电镜镜检发现菜蛾幼虫中肠组织发生明显的病变，杯状细胞微绒毛脱落、断裂，细胞膜性结构坏死，线粒体等细胞器结构变性，部分细胞消融(张雅林等，2003)。斑蝥素触杀菜蛾后，经电镜观察发现，对虫体壁表皮层的影响不大，其作用部位是皮细胞，皮细胞线粒体内嵴会发生模糊，出现空泡，表现出与胃毒致死的菜蛾中肠细胞类似的超微结构破坏(陈利平等，2011)。以昆虫细胞为实验材料进一步研究，斑蝥素可以迅速穿透细胞膜进入细胞中(汪丽等，2013)，抑制细胞增殖(周晗颖等，2012)。受试细胞出现胞质固缩、胞膜突出、质膜膜泡化、DNA 片段化、凋亡小体产生等细胞凋亡的显著特征，证明斑蝥素导致细胞产生的一系列变化系诱导细胞凋亡所致(陈利平等，2008;张来喜等，2011)。显然，斑蝥素对昆虫具有与现行农药不同的致毒机理。

斑蝥素的主要靶标为一系列的磷酸蛋白磷酸磷酸酶(Phosphoprotein phosphatase，PPP)(Honkanen，1993;Hastie et al.，1998;Prickett et al.，2006;Swingle et al.，2007)，其中蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A，PP2A)广泛参与细胞代谢，DNA 的复制、转录，RNA 的剪切、翻译，细胞分化，以及细胞凋亡等过程(Janssens et al.，2001;Lechward et al.，2001;Xu et al.，2006)，在PPP 中的含量最高(Cohen，1997)，其基因表达受到严格的调控(Baharians et al.，1998)。PP2A 全酶由一个二聚体的核心酶和一个可变化的调节亚基B 组成，核心酶又包括催化亚基C 和结构亚基A(Hemmings et al.，1990)。菜蛾作为重要的农业害虫，建立其斑蝥素靶标受体PP2A 催化亚基(PP2Ac)基因的表达系统，可为进一步研究其PP2A 的生理功能、结构特点、与斑蝥素的结合作用原理以及斑蝥素类活性物质防治鳞翅目害虫的改良应用提供重要基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试昆虫菜蛾Plutella xylostella(L)由本实验室长期人工于25±3℃，相对湿度60%-70%的条件下饲养的敏感种群。

RNeasy Plus Mini Kit、QIAquick Gel Extraction Kit 为QIAGEN 公司产品。rTaq DNA 聚合酶、T4连接酶、限制性内切酶Hind Ⅲ与 BamH Ⅰ、2000 bp DNA Marker、1 kb DNA Ladder、蛋白质分子量标准(低)、pMD18T-simple 载体、均为TAKARA 公司产品。M-MLV 反转录酶为Promega公司产品。质粒提取试剂盒为北京天根生化公司产品。宿主菌大肠杆菌DH5α 为北京全式金公司产品。细菌蛋白抽提试剂盒、Ni-Agarose His 标签蛋白纯化试剂盒、抗His 标签鼠单克隆抗体、Goat Anti-Mouse IgG HRP 抗体、DAB 显色试剂盒为北京康为世纪有限公司产品。蛋白预染Marker 为北京博尔优生物技术有限公司产品。pET-30a 质粒、宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)均为本实验室保存。其他所用试剂均为国产分析纯。

1.2 引物设计

根据 GenBank 收录的菜蛾 PP2Ac 基因(GenBank 登录号:KC558556)的ORF 区，利用Primer 5.0 软件设计加入HindⅢ与BamHⅠ酶切位点的引物Px-PP2Ac-Hind Ⅲ、Px-PP2Ac-BamH Ⅰ(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 总RNA 提取与第一链cDNA 合成

将4 龄菜蛾幼虫用液氮研磨后，参照RNeasy Plus Mini Kit 试剂盒说明书的步骤提取总RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性及核酸微量检测仪测定浓度后，使用反转录酶 M-MLV Reverse Transcriptase、引物Oligo(dT)18 合成cDNA 第一链。

1.4 PCR 扩增目的片段

以菜蛾cDNA 为模板，以Px-PP2Ac-Hind Ⅲ、Px-PP2Ac-BamHⅠ为引物进行扩增，PCR 反应条件:95℃预变性5 min;94℃30 s，54℃30s，72℃1 min，35个循环;72℃10 min。反应结束后使用l%琼脂糖凝胶电泳检测并使用QIAquick Gel Extraction Kit 对目的片段进行回收，将回收产物按照pMD18T-simple 载体说明进行连接，之后转入DH5α 内，蓝白班筛选后挑取单克隆菌落培养，经PCR 鉴定后的阳性菌液送至北京中科希林生物技术公司测序。

1.5 pET30a-PP2Ac 原核表达载体的构建

将含有目的基因的T 载体和原核表达载体pET-30a 的质粒分别用Hind Ⅲ和BamH I 进行双酶切，酶切产物经l%琼脂糖凝胶电泳检测和胶纯化后使用T4 连接酶进行连接。连接产物转化至DH5α，卡那霉素(50μg/mL)抗性平板筛选。抗性菌落的质粒经测序验证后命名为pET30a-PXPP2Ac。提取重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中，经卡那霉素抗性平板筛选后，保存抗性菌落用于重组蛋白的表达。

1.6 重组PP2Ac 蛋白表达条件的优化及分析

为了获得大量的重组蛋白，通过对诱导剂IPTG的浓度及诱导温度的调整，筛选最佳的表达条件。

1.6.1 IPTG 诱导浓度的优化取过夜培养的含重组质粒的菌液，按1∶50稀释到含卡那霉素的LB 液体培养基中，37℃，180 rpm振荡培养至OD600=0.5 时，分别加入终浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 mM 的IPTG，在25℃下诱导培养，4 h 后经10000 g 离心5 min收集菌体，使用无菌水重悬后按比例加入SDS 上样缓冲液，100℃煮沸5 min，12%SDS-PAGE 电泳分析重组蛋白的表达情况。

1.6.2 不同温度对重组蛋白表达量及表达形式的影响取过夜培养的含重组质粒的菌液，按1∶50稀释到含卡那霉素的LB 液体培养基中，37℃，180 rpm 振荡培养至OD600在0.5 左右，加入上一步优化确定的 IPTG 至终浓度，18℃、25℃、30℃、35℃下，180 rpm 继续培养4 h 后收集菌体，使用12%SDS-PAGE 电泳分析诱导温度对重组蛋白表达的影响。按照细菌蛋白抽提试剂盒说明，对不同温度下诱导的含重组蛋白的菌液进行裂解，分别取上清和沉淀进行12%SDS-PAGE 电泳，分析不同温度下重组蛋白的表达形式。

1.7 PP2Ac 包涵体蛋白的纯化

根据优化的表达条件，选择使用IPTG 浓度0.2 mM、温度30℃的条件大量诱导表达PP2Ac，取诱导后的菌液及未经诱导的菌液进行12% SDSPAGE 电泳，使用电转印法在100 V 电压下转印1 h至PVDF 膜(0.45μm)上，加入抗His 标签鼠单克隆抗体(1∶3500 稀释)，4℃过夜，再加入Goat Anti-Mouse IgG HRP 抗体(1∶2000 稀释)，取出膜后进行DAB 显色对表达产物进行检验。

表达产物经4℃、12000 r/min 离心10 min 收集，按照Ni-Agarose His 标签蛋白纯化试剂盒说明书进行包涵体蛋白的纯化，经SDS-PAGE 检测纯化的重组蛋白。

2 结果与分析

2.1 目的基因的克隆

以菜蛾cDNA 为模板，对PP2Ac 基因进行扩增的产物，经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示(图1)有一条大小约为940 bp 的条带，与预期结果相符。

图1 PCR 扩增PP2Ac 基因Fig.1 PP2Ac gene amplified by PCR

2.2 菜蛾原核表达载体的构建

小菜蛾PP2Ac 基因的PCR 产物与表达载体pET30a 的质粒DNA，分别使用限制性内切酶HindⅢ与BamHⅠ双酶切后进行连接和转化。经蓝白班筛选，挑取阳性单克隆并进行PCR 鉴定(图2)，确定转化成功后提取重组质粒，使用Hind Ⅲ与BamHⅠ进行双酶切鉴定，得到5.4 Kb 的载体片段以及相应大小为941bp 的目的片段(图3)，说明原核表达载体构建成功，命名为pET30a-PX-PP2Ac。

图2 重组质粒PCR 鉴定Fig.2 PCR verify the recombinant plasmid

图3 Hind Ⅲ与BamHⅠ双酶切鉴定Fig.3 Used restrict enzyme Hind Ⅲand BamH I to verify the recombinant plasmid

2.3 重组蛋白表达条件的优化

2.3.1 不同IPTG 浓度对诱导表达的影响

由SDS-PAGE 电泳结果显示(图4)，在全菌液中重组蛋白表达量随着IPTG 浓度的提高而增加，但是非目的蛋白的表达量也有所增加，在使用终浓度为0.2 mM 的IPTG 诱导时，非目的蛋白存在较少同时可大量表达目的蛋白，因此确定该浓度为表达重组蛋白的最佳浓度。

图4 25℃下不同IPTG 浓度下诱导pET30a-PX-PP2Ac 蛋白表达Fig.4 Different concentration of IPTG induced pET30a-PX-PP2Ac protein expression under 25°C

2.3.2 不同温度对重组蛋白表达量及表达形式的影响

在菌液中加入终浓度为0.2 mM 的IPTG，以温度为18、25、30、35℃的条件下对菌液进行诱导表达，由图5 可见，目的蛋白的表达量浓度随着温度的升高而增加。但是，图6 显示在不同温度诱导的菌体的裂解液中，目的蛋白均以包涵体形式存在于沉淀中，菌体裂解液的上清中没有可溶性蛋白。

图5 0.2 mM IPTG 诱导，不同温度下pET30a-PX-PP2Ac 的蛋白表达Fig.5 0.2 mM concentration of IPTG induced pET30a-PX-PP2Ac protein expression under different temperature

图6 不同温度下pET30a-PX-PP2Ac 重组蛋白的表达形式Fig.6 Existence form of the pET30a-PXPP2Ac protein expression under different temperature

2.4 重组蛋白的纯化

经Western Blot 对诱导产物进行检测后可见(图7)，诱导的菌液在35-40 KDa 间出现一条与目的蛋白大小相符的条带，这说明菌液中的蛋白与抗His 标签的抗体间具有良好的特异性反应，而未经诱导的菌液没有条带的产生，结果显示诱导表达的产物是具有His 标签的目的蛋白。

图7 Western blot 分析PP2Ac 蛋白Fig.7 Western blot analysis of thePP2Ac protein

目的蛋白经纯化后，通过12%SDS-PAGE 检测，结果显示(图8)，使用300 mM 咪唑洗脱液对结合了目的蛋白的镍柱进行洗脱，在第2、3 mL洗脱液中出现了大小约38 KD 目的蛋白，由于目的蛋白周围无杂带，可以将其分离后进行后续的相关研究使用。

图8 pET30a-PX-PP2Ac 表达蛋白的纯化Fig.8 Purify the pET30a-PX-PP2Ac protein of expression

3 结论与讨论

大肠杆菌表达系统是基因工程中常用的表达工具，但是在表达外源基因的过程当中，常会遇到表达效率不高、产率较低、蛋白表达无活性等问题。诱导条件的改变对于目的蛋白的表达具有一定的影响。有报道称，较低浓度的IPTG 即可诱导外源蛋白的大量表达(张嘉萱等，2011)。本试验结果显示IPTG 浓度为0.2 mM 时即可诱导pET30a-PX-PP2Ac 的大量表达，随着IPTG 浓度的增加，重组蛋白的表达量并无明显提高，但非目的蛋白的表达量有所增加，所以选用终浓度为0.2 mM 的IPTG 诱导该蛋白的表达。降低诱导温度可以增加重组蛋白的可溶性表达和表达产物的活性，使包涵体的比例下降(宛传丹等，2004;李琳，2010)。在本试验中分别在18、25、30、35℃对重组蛋白进行诱导表达，将菌体裂解后分析蛋白的表达形式，结果表明重组蛋白均存在于沉淀中，以包涵体的形式存在，由此可见菜蛾PP2Ac 在原核表达中受诱导条件改变的影响不大，较难产生可溶性蛋白。为了解决这一问题，可考虑选用其他表达系统，对目的蛋白进行表达(吴丹等，2002)。

目前，斑蝥素作为杀虫剂已经开发应用(张雅林等，2006)，并且在我国已被作为农药产品投放市场，也明确了斑蝥素与有关杀虫剂混用的增效作用(刁绍东等，2003;魏列新等，2007;郑胜礼等，2007)。但是，斑蝥素对昆虫的毒杀机理及作用机制尚不完全明确。本试验选取IPTG 终浓度0.2 mM、温度30℃为表达条件大量表达目的蛋白后，经纯化后得到了可分离的包涵体蛋白。此蛋白的获得为研究PP2A 蛋白结构奠定了基础，一方面有利于明确斑蝥素与PP2Ac 间的结合作用，丰富对斑蝥素杀虫作用机理的了解;另一方面，可从菜蛾PP2A 的蛋白结构入手，比较昆虫与哺乳动物间的差异，并以此为基础对斑蝥素及其类似物农药在化学结构上进行修饰，从而提高对靶标生物的药效。同时，利用纯化的蛋白作为抗原制备单克隆抗体对昆虫体内的PP2A 蛋白分布进行免疫检测，可以掌握受体蛋白在虫体的分布，对斑蝥素类农药的剂型改良及施用方式等具有一定的指导意义。此外，还可将单抗固定在惰性固相基质上制成层析柱(王莉等，2007)，使PP2A 蛋白质与单抗特异性结合，对PP2A 蛋白质进行分离纯化，从而高效、大量的获得目的蛋白，为进一步明确斑蝥素及其类似物在杀虫过程中与靶标受体PP2A 的作用过程提供基础。

References)

Baharians Z，Schönthal AH.Autoregulation of protein phosphatase type 2A expression［J］.Journal of Biological Chemistry，1998，273(30):19019-19024.

Chen LP，Yang BD，Zhang ZY，et al.Effect of cantharidin on the integument structure of Plutella xylostella［J］.Chinese Journal of Applied Entomology，2011，48(6):1779-1785.［陈利平，杨宝东，张志勇，等.斑蝥素对小菜蛾体壁组织结构的影响［J］.应用昆虫学报，2011，48(6):1779-1785］

Cheng LP，Yang BD，Zhang ZY，et al.Effects of Cantharidin on insect cell spex-Ⅶ and Sf9［J］.Journal of Beijing University of Agriculture，2008，23(4):17-20.［陈利平，杨宝东，张志勇，等.斑蝥素对昆虫细胞Spex-Ⅶ和Sf9 的作用效果［J］.北京农学院学报，2008，23(4):17-20］

Cohen PT.Novel protein serine/threonine phosphatases:variety is the spice of life［J］.Trends Biochem.Sci.，1997，22:245-251.

Diao SD，Wang J，Gu MJ，et al.Study on applied techniques of natural watery pesticide 0.1% Cantharidin［J］.Pesticides，2003，42(8):36-37.［刁绍东，王菁，顾明洁，等.天然源农药0.1%斑蝥素水溶剂的应用技术［J］.农药，2003，42(8):36-37］

Feng X，Li ZY，Wu QJ.Research progress of the resistance management and sustainable control of diamondback moth(Plutella xylostella)in China［J］.Chinese Journal of Applied Entomology，2011，48(2):247-253.［冯夏，李振宇，吴青君.小菜蛾抗性治理及可持续防控技术研究与示范——公益性行业(农业)科研专项“小菜蛾可持续防控技术研究与示范”进展［J］.应用昆虫学报，2011，48(2):247-253］

Hastie CJ，Cohen PTW.Purification of protein phosphatase 4 catalytic subunit:Inhibition by the antitumour drug fostriecin and other tumour suppressors and promoters［J］.FEBS Lett.，1998，431:357-361.

Hemmings BA，Adams-Pearson C，Maurer F，et al.Alpha-and betaforms of the 65-kDa subunit of protein phosphatase2A have asimilar 39 amino acid repeating structure.Biochemistry，1990，29(13):3166-3173.

Honkanen RE.Cantharidin，another natural toxin that inhibits the activity of serine/threonine protein phosphatases types 1 and 2A［J］.Federation of European Biochemical Societies，1993，330(3):283-286.

Huang J，Wu WJ.Advance of studies on insecticide resistance to diamondback moth(Plutella xylostella L.)［J］.Journal of Guizhou University(Natual Science)，2003，20(1):97-104.［黄剑，吴文君.小菜蛾抗药性研究进展［J］.贵州大学学报(自然科学版)，2003，20(1):97-104］

Janssens V，Goris J.Protein phosphatase 2A:a highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling［J］.Biochem.J，2001，353:417-439.

Lechward K，Awotunde OS，Swiatek W，et al.Protein phosphatase 2A:variety of forms and diversity of functions［J］.Acta Biochimica Polonica(English Edition)，2001，48(4):921-934.

Li L，Pan Y，Wang ZM，et al.Optimization on soluble expression of hepatitis c virus RNA-dependent RNA polymerase in E.coli［J］.Pharmaceutical Biotechnology，2010，17(3):207-211.［李琳，潘英，王正茂，等.丙型肝炎病毒RNA 依赖的RNA 聚合酶在大肠杆菌中可溶性表达条件的优化［J］.药物生物技术，2010，17(3):207-211］

Li XC，Wang YC.Progress in target-insensitive mechanism of insect resistance to insecticides［J］.Acta Entomologica Sinica，1998，41(4):417-422.［李显春，王荫长.昆虫抗药性靶标不敏感机制的研究进展［J］.昆虫学报，1998，41(4):417-422］

Liu RR，Ma Y，Ma ZQ，et al.Bioactivity of cantharidin against eleven pests［J］.Journal of Northwest A ＆ F University(Natural Science)，2010，38(11):181-185.［刘瑞瑞，马燕，马志卿，等.斑蝥素对11种害虫的杀虫活性［J］.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2010，38(11):181-185］

Liu X，Niu F，Wang K.Studies on resistance to insecticides and control measures in diamond back moth(Plutella xylostella L.)［J］.Pesticide Science and Administration，2013，34(2):51-55.［刘霞，牛芳，王开运.小菜蛾抗药性研究现状及防治措施［J］.农药科学与管理，2013，34(2):51-55］

Prickett TD，Brautigan DL.The alpha 4 regulatory subunit exerts opposing allosteric effects on protein phosphatases PP6 and PP2A［J］.J.Biol.Chem.，2006，281:30503-30511.

Swingle M，Ni L，Honkanen RE.Small molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases:Specificity，use and common forms of abuse［J］.Methods Mol.Biol.，2007，365:23-38.

Wan CD，Huang YF，Xu XF.Cloning，Prokaryotic expression and purification analysis of human testis sperm protein SP22［J］.China Biotechnology，2004，24(12):59-63.［宛传丹，黄宇烽，许晓风.人精子蛋白SP22 的cDNA 克隆、表达及纯化分析［J］.中国生物工程杂志，2004，24(12):59-63］

Wang L，Liu DJ，Li LZ.Advancesof application of affinity chromatography to research on protein［J］.Physical Testing and Chemical Analysis Part B(Chemical Analysis)，2007，43(6):515-517.［王莉，刘道杰，李连之.亲和层析在蛋白质研究中的应用进展［J］.理化检验(化学分册)，2007，43(6):515-517］

Wang L，Zhang X，Zhang ZY，et al.Effect of cantharidin on cell membrane integrity and potential in Spodoptera frugiperda Sf9 cells［J］.Acta Entomologica Sinica，2013，56(5):512-520.［汪丽，张来喜，张志勇，等.斑蝥素对草地贪夜蛾Sf9 细胞膜完整性和膜电位的影响［J］.昆虫学报，2013，56(5):512-520］

Wei LX，Liang QL，Shen HM，et al.Bioactivity of 1.5% cantharidin aqueous solution on armyworm［J］.Agrochemicals，2007，46(4):272-273.［魏列新，梁巧兰，沈慧敏，等.1.5%斑蝥素AS 对粘虫的生物活性［J］.农药，2007，46(4):272-273］

Wu D，Qiu HJ，Tong GZ.Comparison of several expression systems［J］.Biotechnology Bulletin，2002，2:30-34.［吴丹，仇华吉，童光志.几种表达系统的比较［J］.生物技术通报，2002，2:30-34］

Xu YH，Xing YN，Chen Y，et al.Structure of the protein phosphatase 2A holoenzyme［J］.Cell，2006，127:1239-1251.

Zhang JX，Lu JX，Wang R，et al.Cloning and expression of human TRAP1 gene and optimization of expression conditions［J］.Biotechnology Bulletin，2001，8:161-166.［张嘉萱，卢嘉欣，王蕊，等.人TRAP1 基因的克隆、原核表达及表达条件优化［J］.生物技术通报，2011，8:161-166］

Zhang LX，Yang BD，Zhang MZ，et al.Critical condition of apoptosis of Spodoptera frugiperda Sf9 cells lead by cantharidin［J］.Journal of Beijing University of Agriculture，2011，24(2):14-17.［张来喜，杨宝东，张民照，等.斑蝥素诱导草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系Sf9 凋亡的临界条件［J］.北京农学院学报，2011，24(2):14-17］

Zhang YL，Zheng SL，Zhang X.A pesticide combination with cantharid in［P］.CN1762215A，2006.［张雅林，郑胜礼，张兴.一种含斑蝥素杀虫剂组合物［P］.中华人民共和国专利:CN1762215A，2006］

Zhang YL，Zhou Y，Zhang ZY.Effect of cantharidin on the midgut of the orient armyworm(Mythimna separata)and diamondback moth(Plutella xylostella)［J］.Acta Entomologica Sinica，2003，46(3):272-276.［张雅林，周越，张志勇.斑蝥素对粘虫和小菜蛾幼虫中肠组织的影响［J］.昆虫学报，2003，46(3):272-276］

Zhang ZY，Yuan F，Zhang X，et al.The insecticidal function of cantharidin to the larvae of diamondback moth［J］.Acta phytophylacica sinica，1998，25(2):166-170.［张志勇，袁峰，张兴，等.斑蝥素对菜蛾幼虫的毒杀作用研究［J］.植物保护学报，1998，25(2):166-170］

Zhang ZY，Yuan F.A review on the research of cantharidin resource and its utilization［J］.Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，1996，5(4):89-92.［张志勇，袁锋.斑蝥素资源及其利用的研究进展［J］.西北农业学报，1996，5(4):89-92］

Zhao HL，You MS.Advances in research on the insecticide resistance of diamondback moth(Plutella xylostella L.)and its management［J］.Entomaological Journal of East China，2001，10(1):82-88.［赵怀玲，尤民生.小菜蛾抗药性及其治理对策的研究进展［J］.华东昆虫学报，2001，10(1):82-88］

Zheng SL，Zhang YL，An FX，et al.The synergism of cantharidin mixture with some insecticides［J］.Acta Phytophylacica Sinica，2007，34(1):83-86.［郑胜礼，张雅林，安粉霞，等.斑蝥素与几种杀虫剂混配的增效作用［J］.植物保护学报，2007，34(1):83-86］

Zhou HY，Yang BD，Zhang MZ，et al.Comparisons of inhibition between cantharidin and norcantharidin on Sf9 cells［J］.Journal of Environmental Entomology，2012，34(2):154-160.［周晗颖，杨宝东，张民照，等.斑蝥素与去甲斑蝥素对昆虫细胞Sf9 抑制作用比较［J］.环境昆虫学报，2012，34(2):154-160］