基于化学成分和生物效应的栝楼桂枝汤质量评价研究

李煌+乔丽菲+张玉琴+许文+徐伟+褚克丹+林羽

[摘要] 该研究采用超高效液相色谱-串联质谱的方法，分析测定栝楼桂枝汤中的24种化学成分，在此基础上，结合吗替麦考酚酯诱导的斑马鱼神经元损伤药效模型对栝楼桂枝汤进行神经保护生物活性评价，旨在探讨建立一种综合化学成分与生物效应的栝楼桂枝汤质量评价模式，研究结果表明建立的方法可行，基本稳定可靠，可为中药复方的质量控制研究提供参考。

[关键词] 栝楼桂枝汤； 超高效液相色谱-质谱； 斑马鱼神经损伤模型

[Abstract] The paper was aimed to establish a quality evaluation model for Gualou Guizhi decoction based on the chemical compositions and biological effects. Ultra high performance liquid chromatograph-mass spectrometer was used to analyze and determine 24 kinds of chemical compositions in Gualou Guizhi decoction， and then， biological activity effect was quantitatively assessed in a zebrafish neuronal injury model which was induced by mycophenolate mofetil （MMF）. As a result， the established method for quality evaluation of Gualou Guizhi decoction based on the chemical compositions and biological effects is feasible， stable and reliable， which can provide reference for quality control of compound Chinese medicines.

[Key words] Gualou Guizhi decoction； UPLC-MS； Zebrafish neuronal injury model

在保证安全性的前提下，中药复方的质量控制，其关键在于评价其有效性与可控性。然而目前的质控方法，主要通过检测一种或某几种有效成分来进行评价，存在一定的缺陷，如缺乏质量控制的科学性与系统性，存在非法添加对照品的风险等。随着近年来生物活性测定法，具有整体可控，药效密切相关等优势的凸显，已逐渐成为中药质量控制和评价的重要发展方向[1-4]。

栝楼桂枝汤，处方来源于张仲景的《金匮要略》，具有解肌祛邪，舒缓筋脉之功效。在课题组前期的研究中发现，该方通过多途径发挥对MCAO模型大鼠的脑保护作用[5-9]。目前，斑马鱼模型已被广泛应用于中枢神经保护的药物活性筛选[10-12]。本实验在采用超高效液相色谱-串联质谱分析测定化学成分的基础上，结合斑马鱼神经元损伤模型，进行栝楼桂枝汤对中枢脑保护的生物活性检测，初步探索建立基于化学测定和生物活性的中药复方质量评价模式，为丰富中药复方质量控制研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪，Xevo TQD三重四级杆质谱仪（美国Waters公司）；KQ-500DE数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；解剖显微镜（SZX7，OLYMPUS，Japan）；与显微镜相连的相机（TK-C1481EC）；精密电子天平（CP214，OHAUS，America）；AZ100型荧光显微镜（尼康公司）；NIS-Elements D 3.10 高级图像处理软件（Media Cybernetics 公司）。

1.2 试剂

没食子酸甲酯、芍药内酯苷、2-羟基肉桂酸、酸枣仁皂苷A，购自于成都曼斯特生物科技有限公司，纯度均≥98%；没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、对羟基苯甲酸、香草酸、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、甘草酸、6-姜酚、甘草次酸、獐牙菜苦苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、4-羟基苯甲酸甲酯，购自于中国食品药品检定研究院，纯度均≥99%；氧化芍药苷、4-羟基肉桂酸、紫云英苷、3-羟基肉桂酸、异甘草苷、甘草查尔酮A、8-姜酚、6-姜烯酚购于上海同田生物科技有限公司，纯度均≥98%。

色谱纯乙腈（美国Merck公司）；水为超纯水。吗替麦考酚酯（购自上海晶纯实业有限公司，批号H14J6335），吖啶橙染料（Alorich，批号494-38-2）；谷胱甘肽，简称GSH，上海晶纯实业有限公司，批号为45463；甲基纤维素（Aladdin，Shanghai，China）。

1.3 药材

栝楼、白芍、桂枝、甘草、生姜、大枣购自福州回春中药饮片厂有限公司，上述药材经福建中医药大学中药鉴定教研室黄泽豪副教授鉴定，均符合2015年版《中国药典》相关要求。

2 方法

2.1 栝楼桂枝汤制备

取生姜、桂枝药材，分别按10倍加量水，采用水蒸气蒸馏法提取6 h，并收集其挥发油，再将上述药渣与处方中其他4味药材混合，按处方比例加入10倍水，煎煮2次，每次1.5 h，过滤合并药液，浓缩药液，置-4 ℃冰箱保存备用。

2.2 超高效液相色谱分析测定栝楼桂枝汤中的24种成分

2.2.1 UPLC的色谱条件

色谱柱：Waters CORTECS C18（2.1 mm×100 mm，1.6 μm），流动相为水（含0.1%甲酸，A）-乙腈（B），梯度洗脱，条件见表1，流速0.25 mL·min^-1。进样量为1 μL，柱温为 45 ℃。

质谱条件：去溶剂气体为氮气，碰撞气体为氩气，离子源温度150 ℃，毛细管电压3.0 KV，锥孔电压30.0 V，去溶剂气体流量800 L·h^-1，锥孔气流50 L·h^-1，脱溶剂温度200 ℃。

2.2.2 混合对照品溶液的制备

称取 24 種待测物标准品和 3 种内标物标准品适量，精密称定，甲醇适量超声溶解，定容制刻度，摇匀，分别制备成浓度为1.00 g·L^-1的对照品母液和内标储备液。

2.2.3 供试品溶液溶液的制备

精密吸取栝楼桂枝汤适量，置于25 mL量瓶中，先加50%甲醇45 mL超声提取30 min，静置，放冷，再用50%甲醇定容，摇匀，静置，取一定量至EP管中，12 000 r·min^-1离心10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2.4 系统适用性试验

2.2.4.1 线性关系考察 取上述24种对照品的储备液，精确配制不同浓度梯度的混合对照品溶液，在上述色谱条件下分别进样测定，重复3 次，将各成分特征碎片离子峰面积平均值（Y）与被测组分的质量浓度（X，mg·L^-1）进行线性分析，获得回归方程、相关系数及线性范围；以信噪比（S/N）等于3，计算24种待测成分的检出限LOD，以信噪比（S/N）等于10，计算24种待测组分的定量限LOQ，结果见表2。

2.2.4.2 精密度、稳定性、重复性及回收率试验 按照药典的相关要求，分别进行了仪器精密度、样品的稳定性、重复性及回收率试验，试验结果均符合要求。

2.2.5 3批栝楼桂枝汤样品的含量测定

分别精密称取3批样品，按2.2.3项制备栝楼桂枝汤样品溶液，按2.2.1项下色谱，质谱条件进行样品测定，分别将各成分峰面积代入相应的回归方程，计算获得样品中24种活性成分的含量，其结果见表3。

2.3 栝楼桂枝汤对斑马鱼中枢神经的保护作用

随机选取270尾受精后1 d野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼，用吗替麦考酚酯诱发斑马鱼中枢神经损伤。分别水溶给予A组60，100，130 mg·L^-1和B组924，1 540，2 000 mg·L^-1，阳性对照药GSH 154 mg·L^-1，同时设置正常对照组（养鱼用水处理斑马鱼）和模型对照组，每孔（实验组）容量为3 mL。A组和B组分别与吗替麦考酚酯共同处理24 h后，用吖啶橙进行染色，染色后每个实验组随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照并采集数据，用NIS-Elements D 3.10 高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼中枢神经凋亡细胞荧光强度（S），进行定量分析，并统计。统计学处理结果用±s表示，A组和B组对斑马鱼中枢神经的保护作用计算公式如下。

中枢神经保护作用=S模型对照组-S供试品组S模型对照组-S正常对照组×100%

结果采用方差分析和Dunnett′s t-检验进行统计学分析，P<0.05表明具有显著性差异。

3 结果与分析

3.1 栝楼桂枝汤中24种成分的UPLC测定

在上述色谱条件下对照品和栝楼桂枝汤的色谱见图1，2，所有样品在保留时间6.5 min内，均得到较好的分离；栝楼桂枝汤测定24种成分的回归方程、相关系数及线性范围结果见表2，3批栝楼桂枝汤含量测定结果见表3。

3.2 斑马鱼损伤模型的建立

采用0.25 mol·mL^-1吗替麦考酚酯处理受精后1 d野生型AB品系斑马鱼24 h，建立斑马鱼中枢神经损伤模型。AO 染料染色，凋亡细胞呈荧光绿色，荧光显微镜下拍照观察斑马鱼神经凋亡细胞荧光强度来判断造模成功率（造模成功率95%），见图3。斑马鱼凋亡细胞荧光强度定量分析可对药物对神经细胞保护效率进行快速、可靠的评价。

3.3 栝楼桂枝汤对斑马鱼损伤模型的最大耐受浓度测定

栝楼桂枝浓缩干燥的粉末，采用养殖用水配制成2 g·L^-1母液，实验时，现场配制成1，10，100，250，500，1 000，2 000 mg·L^-1质量浓度的样品溶液，结果显示在2 000 mg·L^-1时，除吗替麦考酚酯诱导的毒性（躯干弯曲，脑袋变性）外，对斑马鱼未产生其他毒副作用，也未引起斑马鱼死亡，且2 000 mg·L^-1为最大耐受浓度检测上限。因此确定栝楼桂枝汤对斑马鱼MTC为2 000 mg·L^-1。

3.4 栝楼桂枝汤对斑马鱼中枢神经的保护作用

将栝楼桂枝汤母液为2 g·L^-1，分别加入1 386，2 310，3 000 μL到3 mL养殖用水中，配制成低、中、高3个剂量组（924，1540，2 000 mg·L^-1）。按2.3项下方法测定栝楼桂枝汤处理下斑马鱼凋亡细胞F，计算神经细胞保护率P，结果见表4。

模型对照组斑马鱼中枢神经凋亡细胞荧光强度与正常对照组比较P<0.001，表明模型建立成功；阳性对照药GSH 154 mg·L^-1组斑马鱼中枢神经凋亡细胞荧光强度为83 460像素，与模型对照组比较P<0.001，其对斑马鱼中枢神经保护作用为83%，说明GSH对斑马鱼中枢神经有保护作用。

栝楼桂枝汤的924，1 540，2 000 mg·L^-1组斑马鱼中枢神经凋亡细胞荧光强度分别为106 711，69 716，70 174像素，中枢神经保护作用分别为65%，93%，93%，与模型对照组比较，各组均P<0.001，提示栝楼桂枝汤在本实验浓度条件下对斑马鱼中枢神经有明显的保护作用，见表4，图4。

4 讨论

4.1 色谱条件的优化

考虑到栝楼桂枝汤中，可能存在着同分异构体易造成干扰的问题，如桂枝药材存在2，3，4-位，3种不同位置的羟基肉桂酸；白芍中芍药苷与芍药内酯苷，结构上仅差1个酯键；甘草药材中的甘草苷与异甘草苷等成分，其母离子和子离子完全一样，若未能选择好色谱条件，则可能影响质谱检测。因此，本实验首先对流动相的进行了优选，预实验中考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.02 mol·L^-1乙酸铵、乙腈-0.02 mol·L^-1乙酸铵-0.1%甲酸水等流动相条件。结果发现：①甲醇体系的分离度不如乙腈体系；②甲酸或乙酸铵对色谱分离及峰形改善均有作用，但其对质谱响应与峰形改善程度与单用甲酸相差不大，故本实验选择乙腈-0.1%甲酸作为流动相。

其次，实验中筛选了不同类型的色谱柱Waters CORTECS C18，Waters HSS T3 C18，Phenomenexkintecx，结果发现1.6 μm的超高效液相色谱柱，其分离效果和检测的灵敏度均高于其他色谱柱，且达到基线分离的分析时间缩短，分离的效率较高，所以本实验中选择Waters CORTECS C18色谱柱。

4.2 质谱条件优化

结合文献研究，栝楼桂枝汤中主要成分为白芍萜苷類及甘草三萜酸类成分。实验中分析比较了正、负离子检测模式等质谱条件，发现上述2类成分在负离子模式条件下检测灵敏度显著高于正离子模式，并且其他化合物在该模式下也有稳定的子离子和较高的响应度，故最终选择负离子模式。

4.3 栝楼桂枝汤化学成分与药效相关性

中药复方质控评价体系的建立其指标选择是关键问题，本文选择的分析测定成分主要基于以下方面考虑，一是前期研究发现的复方中具有透过血脑屏障的作用成分如：如没食子酸、芍药苷、甘草素、甘草苷等[7]；或已有文献报道具有神经保护作用成分芍药内酯苷[13]、6-姜酚[14]、甘草酸[15]；此外，还包括了构成复方各味药材的药典主要测定指标。

4.4 斑马鱼中枢神经保护药效学实验

目前缺氧缺血再灌注脑损伤的模型，通常选择大鼠、猪、羊，鉴于造模后的大鼠往往没有任何精神、运动障碍的表现，而采用羊、猪胎儿模型则实验成本较高[16]。因此，建立一个新型、经济、简便且能大量繁殖的动物模型，对缺氧缺血再灌注脑损伤的研究，具有重要的意义。

斑马鱼作为一种新型模式动物，具有易于饲养、发育快速、胚胎透明、繁殖力强等特点，已在药物活性筛选中广泛应用[17-18]，特别是在神经系统疾病领域，如，李晓稳等[10]建立了采用斑马鱼神经元损伤模型评价养血清脑颗粒神经细胞保护作用的模式。陈衍晨等[11]研究发现，缺氧会导致斑马鱼脑细胞内c-fos基因表达上调，可能是导致缺氧后期脑细胞凋亡激增的机制之一。Buenafe等[19]发现丹参丙酮粗提物能够抑制戊四氮诱导的斑马鱼胚胎癫痫发作。

[致谢] 斑马鱼中枢神经保护实验得到了杭州环特生物科技有限公司的技术支持。

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[责任编辑 孔晶晶]