基于金纳米粒子的动态光散射法检测溶液中的汞离子

2014-12-16马立娜刘殿骏王振新

分析化学 2014年3期

马立娜+刘殿骏+王振新

摘要发展了一种基于汞离子（Hg2+）适配体（Aptamer）免标记金纳米粒子的动态光散射（DLS）法，用于灵敏、选择性的检测溶液中的Hg2+。Aptamer 5′ TTTCTTCTTTCTTCCCCCCTTGTTTGTTGTTT 3′与Hg2+的特异性结合使金纳米粒子失去保护，在含有100 mmol/L NaCl的缓冲溶液中发生聚集，金纳米粒子的平均水合粒径变大。在pH=7.43，110 nmol/L Aptamer ，100 mmol/L NaCl，Hg2+与Probe DNA孵育时间为30 min的实验条件下，金纳米粒子水合粒径的变化值（

SymbolDA@ D）与Hg2+的浓度成正比。检出Hg2+的线性范围为0.1 nmol/L～5 μmol/L，检出限达0.1 nmol/L。湖水及矿泉水两种水样加标实验表明本方法能够用于实际水样中Hg2+的检测。

关键词汞离子；动态光散射（DLS）；汞离子适配体（Aptamer）；金纳米粒子

1 引言

作为全球性环境污染物，汞具有致畸、致癌作用，是蓄积性毒物，对人体健康危害严重[1]。常用的汞检测方法有冷原子吸收光谱法（CAAS）[2]、电感耦合等离子体质谱法（ICP MS）[3]、冷原子荧光光谱法（CAFS）[4]等，这些方法的优点是准确度比较高，缺点是均依赖大型仪器，成本比较高，需要熟练的操作人员，预处理过程繁琐耗时，不能满足环境监测中高效低成本的需要。

近年研究发现，Hg2+能介导胸腺嘧啶（T）配对，形成稳定的T Hg2+ T特异性结构[5]。金纳米粒子（GNPs）具有较高的摩尔消光系数，大的比表面积，与粒子形状、大小、聚集程度以及粒子之间距离相关的光学性质等特点[6]，可设计一系列生化反应以改变GNPs间的距离，从而实现对靶标物质的检测。可将GNPs的光学特性和T Hg2+ T特异性结构相结合用于检测Hg2+＼[7，8]，该类方法的特异性强、操作简单。

动态光散射技术（Dynamic light scattering， DLS），是指通过测量样品散射光强度变化得出样品颗粒大小信息的一种技术。这种方法测量过程不干扰样品本身的性质，能够反映出溶液中样品分子的真实状态，测量过程迅速，检测灵敏度高，能够实时监测样品的动态变化。目前，这种方法已经被应用于检测金属离子[9，10]和癌症标记物[11]等。本研究结合GNPs的光学特性和T Hg2+ T特异性结构，运用DLS的方法检测溶液中的Hg2+，比文献＼[7]灵敏度提高了3个数量级，且方法具有较好的选择性。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Zetasizer Nano ZS 90动态光散射粒度仪（DLS，英国Malvern公司）用于测量粒子的水合粒径，实验操作条件为：温度25 ℃，散射角度90°，激光器波长633 nm； Mini 1240型紫外可见分光光度计（日本Shimadzu公司）； iCAP 6300型电感耦合等离子体原子发射光谱仪（ICP AES，美国Thermo公司）； H600型透射电子显微镜（TEM，日本Hitachi公司）。氯金酸（HAuCl4·3H2O，Sigma Aldrich公司）。DNA（上海生工生物工程有限公司），Hg2+ aptamer（Probe DNA）序列如下：5′ TTTCTTCTTTCTTCCCCCCTTGTTTGTTGTTT 3′，对照DNA（Control DNA）序列如下：5′ AAACGGCAAAACATCCCCCCAAGTAAGAAGAAA 3′[12]，DNA的浓度由260 nm处测得的紫外吸光度确定，其消光系数等于链中所含各碱基的摩尔消光系数之和。4 羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPEs，北京鼎国生物技术有限责任公司），乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA），NaCl，NaOH，Al2（SO4）3·18H2O，MgCl2·6H2O，CaCl2，BaCl2·2H2O，ZnCl2，CuSO4·5H2O，CoCl2·6H2O，3CdSO4·8H2O，Fe2（SO4）3，Pb（CH3COO）2，Hg（NO3）2·H2O及其它实验用试剂均为分析纯试剂，购于北京化工厂。实验用水为Milli Q （18.2 MΩ cm）超纯水。

2.2 金纳米粒子的制备

按照Frens Turkevich方法[13，14]合成金纳米粒子。取100 mL 超纯水置于250 mL三颈瓶中，冷凝回流及磁力搅拌下油浴加热至沸腾；取1% 氯金酸溶液2 mL加入到三颈瓶中，溶液变为浅黄色。在氯金酸的沸腾溶液中，迅速加入1% 柠檬酸钠溶液8 mL，溶液颜色先变为苍白色，随后变为蓝色，最后变为深红色。继续搅拌加热30 min，缓慢冷却至室温，置于细口瓶中备用。

2.3 金属离子检测

将4 μL 10 μmol/L Probe DNA先与180 μL含有不同浓度Hg2+的HEPEs缓冲溶液（100 mmol/L，pH 7.43）反应30 min，加入200 μL GNPs继续反应10 min后，加入适量NaCl溶液，使溶液的总体积为400 μL， NaCl最终浓度为100 mmol/L。加入NaCl 3 min后测GNPs水合粒径。以相同浓度的Control DNA与Hg2+作用为对照实验。实验平行测定3次。

2.4 EDTA恢复实验

将4 μL 10 μmol/L Probe DNA与180 μL 500 nmol/L Hg2+反应30 min，再加入不同浓度的EDTA及3 μL 1 mmol/L NaOH溶液反应30 min，继续加入200 μL GNPs反应10 min后，加入适量NaCl溶液，使NaCl的最终浓度为100 mmol/L，溶液的总体积为400 μL。加入NaCl 3 min后测GNPs水合粒径。

3 结果与讨论

3.1 金纳米粒子的表征

紫外可见吸收光谱法测得所合成的GNPs的最大吸收峰为520 nm，GNPs粒径的TEM表征结果为（14.0±1.5） nm，DLS表征结果为（24.2±0.5） nm。因为DLS测得的是GNPs的水合粒径，TEM则直接测得金核的大小，所以DLS的表征结果高于TEM的表征结果[15]。

3.2 检测原理

Fig.1 Schematic representation of label free gold nanoparticles （GNP） based dynamic light scattering （DLS） assay for Hg2+ detection并且取决于Probe DNA的构象和方位性。由于GNPs的静电吸引力，Probe DNA发生瞬间结构变化，碱基朝着GNPs，不可逆的吸附在GNPs上。因Probe DNA分子间的静电排斥作用，在较高离子强度时，GNPs依然能够保持单分散状态，此时测得的GNPs水合粒径以D0表示。当溶液中存在Hg2+时，由于Hg2+和Probe DNA介导配对形成T Hg2+ T特异性结构的能力大于Probe DNA与GNPs之间的作用力，从而导致Probe DNA自身弯折形成双链结构，从GNPs表面脱离，在较高离子强度下，无保护的GNPs易发生团聚，使GNPs的水合粒径变大[16，17]，此时测得的GNPs水合粒径以D表示。Hg2+ aptamer与Hg2+间特定专一的相互作用，使得本方法具有良好的选择性。

3.3 实验条件的优化

为获得最佳的实验结果，考察了溶液pH值，Probe DNA浓度，NaCl浓度以及Hg2+与Probe DNA孵育时间对Hg2+检测结果的影响。以GNPs水合粒径的

SymbolDA@ D值（

SymbolDA@ D=D-D0）作为考察体系聚集程度的标准。如图2所示，在pH 7.43，Probe DNA浓度为110 nmol/L，NaCl浓度为100 mmol/L，Hg2+与Probe DNA孵育时间为30 min时，

SymbolDA@ D值最大。以后的Hg2+检测实验均在此优化条件下进行。

图2 （a）不同pH值，（b）不同Probe DNA浓度，（c）不同NaCl浓度，和（d）不同的Hg2+与Probe DNA孵育时间对

SymbolDA@ D的影响

SymbolDA@ D与Hg2+浓度关系曲线，插图为Hg2+浓度校正曲线

Fig.3 Plot of

SymbolDA@ Dand concentration of Hg2+. The inset is the calibration curve for Hg2+

3.4 Hg2+的测定

在优化的实验条件下对Hg2+进行了检测，如图3所示。随着Hg2+的浓度变大，

SymbolDA@ D值逐渐增大。以Hg2+浓度的对数与

SymbolDA@ D作图，得到Hg2+浓度校正曲线。线性范围为0.1 nmol/L～5 μmol/L，线性相关系数R2=0.99。方法的检出限0.1 nmol/L（3S，S为对照实验经20次测量得到的标准偏差）[18]远低于世界卫生组织（WHO）和美国环境保护局（EPA）规定的饮用水中Hg2+含量标准2.0 μg/L（10 nmol/L）及6.0 μg/L（30 nmol/L）[19，20]，说明本方法满足对实际水样中Hg2+的检测要求。

图4为在不同浓度的Hg2+存在下GNPs的TEM图。溶液中不存在Hg2+时， GNPs呈单分散状态（图4a）； 1 nmol/L Hg2+存在时，有明显的聚集体形成（图4b）；随着Hg2+浓度增大， GNPs聚集程度逐渐增加（图4c，4d）。 TEM表征结果证明Hg2+的存在引起了GNPs聚集。这与DLS的表征结果一致。

图4 （a） 0，（b） 1，（c） 10，和（d） 100 nmol/L Hg2+存在下GNPs的TEM表征图

Fig.4 TEM micrographs of GNPs in the presence of （a） 0，（b） 1，（c） 10， and （d） 100 nmol/L Hg2+， respectively

3.5 EDTA恢复实验

向溶液中依次加入EDTA和NaOH，如图5所示，

SymbolDA@ D值显著降低。这是因为在碱性条件下，EDTA作为强的金属离子螯合剂，能够与Hg2+配位形成更加稳定的配合物，破坏了T Hg2+ T特异结构，从而使Probe DNA恢复自由状态并与GNPs作用，使GNPs在较高离子强度下保持单分散状态。本实验进一步证实，由于Hg2+与其适配体的特异性结合而使GNPs失去Probe DNA的保护，在较高离子强度下发生聚集，GNPs水合粒径变大。

3.6 方法选择性的考察

3.7 实际水样中Hg2+的检测

为了证明本方法的实用性，使用本方法对某湖水和矿泉水两种水样进行加标实验。使用0.22 μm滤膜处理湖水样品。结果如表1所示，检测结果与传统的电感耦合等离子体质谱法（ICP AES）所测数据有很好的一致性，证明本方法能应用于实际水样中Hg2+的检测。本方法具有简单、选择性好、灵敏度高和较宽线性范围等优点。

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