胰岛素对高脂饮食小鼠皮下及附睾周围来源的脂肪细胞血浆纤溶酶原激活物抑制物—1、

刘亚莉等

[摘要] 目的 研究高脂饮食喂养小鼠附睾周围和皮下来源的脂肪细胞血浆纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）、叉头框蛋白C2（FOXC2）及叉头框蛋白O1（FOXO1）表达水平，探讨不同类型肥胖的机制。 方法 20只小鼠随机分为对照组和高脂组，分别给予正常饮食和高脂饮食喂养12周。取其附睾周围及皮下脂肪组织，原代培养前脂肪细胞经分化后，Western blot法测定脂肪细胞中PAI-1的蛋白表达水平，并用RT-PCR法检测胰岛素作用前后高脂组附睾周围及皮下脂肪细胞FOXC2和FOXO1的mRNA表达水平。 结果 高脂组小鼠体重显著高于对照组（P < 0.05）；组内比较小鼠附睾周围脂肪组织PAI-1表达显著高于皮下脂肪组织，差异有统计学意义（P < 0.05）；胰岛素作用后，FOXC2 mRNA水平有所升高，附睾附近脂肪细胞升高明显，与皮下脂肪细胞相比，差异有统计学意义（P < 0.05）；胰岛素作用后，FOXO1 mRNA表达有所降低，附睾附近脂肪细胞降低明显，与皮下脂肪细胞相比，差异统计学意义（P < 0.05）。 结论 高脂小鼠附睾周围和皮下来源的脂肪细胞的PAI-1表达不同，胰岛素作用后FOXC2及FOXO1的表达存在差别，这种差别可能是不同类型肥胖的机制之一。

[关键词] 血浆纤溶酶原激活物抑制物-1；叉头框蛋白C2；叉头框蛋白O1；细胞培养

[中图分类号] R3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）11（a）-0023-05

Effects of insulin on PAI-1， FOXC2 and FOXO1 expression of adipocyte from subcutaneous and around the epididymis of high fat diet mice

LIU Yali1 YI Jiali2 LIU Yiqun1 LIU Jianhui1

1.Department of Health Inspection， Liaoning Medical Vocational College， Liaoning Province， Shenyang 110101， China； 2.Dean's Office， Liaoning Medical Vocational College， Liaoning Province， Shenyang 110101， China

[Abstract] Objective To research the expression of PAI-1， FOXC2 and FOXO1 in adipocyte from subcutaneous and around the epididymis in mice feeding high-fat diet， in order to explore the mechanism of different types of obesity. Methods 20 mice were randomly divided into control group and high fat group. The control group was given normal diet and the high fat group was given high fat diet. After 12 weeks， rats epididymal adipose tissue was taken out to culture preadipocytes， and then differentiationed， the fat cell PAI-1 protein expression was detected by Western blot method. The FOXC2 and FOXO1 mRNA expression before and after insulin action in hyperlipidemia groupepididymal and subcutaneous fat cells around were detected by RT-PCR assay. Results Body weight in high fat group was significantly higher than the control group （P < 0.05）. Within the two groups， PAI-1 expression in adipocyte around the epididymis was significantly higher than the subcutaneous adipose tissue， the difference was statistically significant （P < 0.05）. After effects of insulin FOXC2 mRNA levels increased， epididymal fat cells increased obviously， there was statistically significant difference compared with subcutaneous fat cells（P < 0.05）； the expression of FOXO1 mRNA significantly decreased， epididymal fat cells decreased obviously， there was statisticaly significant difference compared with subcutaneous fat cells （P < 0.05）. Conclusion Different expression in PAI-1 from hyperlipidemic mice subcutaneous and visceral adipose cells， after the action of insulin， there are differences of FOXC2 and FOXO1 expressions. The difference may be one of mechanisms of different types of obesity.

[Key words] PAI-1； FOXC2； FOXO1； Cell culture

随着人们生活节奏的加快和饮食结构的改变，肥胖已经成为一个相当严重的社会问题，这种以体重增加和脂肪组织异常堆积为特点的能量摄入过剩的病理状态，已经成为威胁人类健康的三大流行慢性疾病之一[1]。研究发现，肥胖和超重与胰岛素抵抗、心血管疾病发病风险、睡眠呼吸功能紊乱及某些癌症发病密切相关。然而，对于肥胖人群而言，脂肪分布比脂肪总量的危害更大。临床研究证实与皮下脂肪相比，内脏脂肪才是导致胰岛素抵抗、心血管疾病及血脂异常的重要危险因素[2]。本研究选用正常小鼠和高脂饮食小鼠的皮下和内脏来源的脂肪细胞为研究对象，检测与肥胖、糖尿病及心血管疾病密切相关的因子血浆纤溶酶原激活物抑制物-1（plasminogen activator inhibitor，PAI-1）的表达差异，以及胰岛素在体外干扰脂肪细胞时，对翼状螺旋叉头转录因子家族的叉头框（Forkhead box）蛋白C2（FOXC2）和叉头框蛋白O1（FOXO1）表达的影响，探讨不同类型肥胖可能的发生机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

胎牛血清（FBS）、DME/F-12培养基、红油O购于Hyclone公司，PAI-1抗体购于PTGLAB公司，Triozol Reagent购于美国Invitrogen Life technologies公司，FOXC2及FOXO1荧光定量PCR试剂盒购于宝生物工程（大连）有限公司，引物合成由北京华大基因公司提供。

1.2 实验动物和分组

雄性C57BL/6小鼠20只，体重（20±2）g，购自北京维通利华动物实验技术中心，动物许可证号为SCXK（京）2012-0001，适应性喂养1周后，随机分为对照组和高脂组，各10只。对照组给予普通基础饲料，高脂组给予高脂饲料（高脂饲料为基础饲料中添加猪油和酪蛋白，使饲料58%能量来自脂肪，27%能量来自碳水化合物，15%能量来自蛋白质[3]），喂养12周。自由饮水，每周称重1次。

1.3 样品细胞的收集

断颈处死各组小鼠，75%酒精浸泡鼠体20 min。无菌操作，取双侧附睾脂肪垫及腹部皮下脂肪组织。用PBS漂洗脂肪垫，去除脂肪垫中肉眼可见的血管及纤维组织。将脂肪组织剪成1 mm3的小块，放入无菌试管中，加2%的Ⅰ型胶原酶消化液，37℃水浴中消化。充分摇动，90 min后，加等量的DME/F-12培养基停止消化，用200目尼龙网过滤。取滤过液，1000 r/min离心10 min，弃上清液，加入10%DME/F-12培养基，吹打均匀，再以5×104个/mL浓度接种25 cm培养瓶中，每瓶5 mL培养液，培养箱培养。24 h后，吸弃培养基，以去除漂浮的红细胞，重新加入含10%胎牛血清的DME/F-12培养基5 mL。2 d换液1次。在倒置显微镜下观察细胞形态[4]。

1.4 细胞培养

细胞培养3 d后，长满2/3瓶，进行传代。弃培养液，用PBS洗细胞，倒掉后，加胰蛋白酶消化液0.4 mL，轻轻摇动培养瓶，于培养箱中放置1 min后，倒置显微镜观察，细胞回缩变圆，倒掉消化液，加入DME/F-12培养基3 mL，用吸管轻柔吹打细胞后，倒置显微镜观察见细胞悬浮，分成3瓶，完成传代。

1.5 原代培养脂肪细胞的鉴定

采用油红O脂肪染色法[5]，培养皿中的小鼠前脂肪细胞经过6～7 d，细胞内脂滴开始形成，13～15 d脂滴基本形成。用PBS洗3次，10%甲醛固定10 min后，PBS洗3次，细胞晾干20 min。加油红O工作液静止10 min。苏木精染细胞核10 min后，自来水冲洗，甘油明胶封片，普通显微镜下观察。

1.6 Western blot法检测两组皮下和附睾周围来源的脂肪细胞中PAI-1的表达

提取各组脂肪细胞的总蛋白，4℃ 2000 r/min离心10 min，取上清，BCA试剂盒测定蛋白浓度，与5×SDS上样缓冲液100℃煮沸5 min，以每孔60 μg加入10%SDS-PAGE凝胶中，电泳，转膜3 h。用5%脱脂奶粉在37℃条件下封闭1 h。一抗4℃孵育过夜，TBST洗4次，在暗室用ECL发光，图像扫描并分析结果。采用所测PAI-1条带与内参β-actin条带的光密度比值来表示PAI-1蛋白的表达水平。

1.7 RT-PCR法检测胰岛素干扰前后高脂组脂肪细胞FOXC2和FOXO1 mRNA的表达

1.7.1 提取RNA 分化成熟的各组脂肪细胞，PBS洗涤后分别转入含浓度为0.15 μmol/L[6]胰岛素的DMEM培养基中，培养6 h后收获细胞。按TRIzol说明书操作步骤，采取一步法提取总RNA，采用紫外分光光度计测定260 nm、280 nm OD值，样品-80℃保存备用。RNA浓度和纯度测定取1 μL RNA样本，加79 μL DEPC水，紫外分光光度计测OD260与OD280，二者比值应为1.8～2.0，提示样本中RNA纯度合格。RNA（μg/μL）浓度=OD260×40×稀释倍数/1000。各引物序列见表1。

1.7.2 逆转录合成cDNA 反应体系为10 μL，反应条件为37℃，15 min；85℃，5 s，1个循环。

1.7.3 PCR扩增 以cDNA为模板，GAPDH为参照，反应体系为20 μL。扩增反应条件为95℃ 30 s，1个循环；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min；95℃ 15 s，1个循环。

1.7.4结果判定 根据系统给出的Ct进行结果判定。Ct目的-Ct内参即为该标本的ΔCt。计算出2-ΔΔCt，以代表脂肪组织mRNA的表达水平。

表1 GAPDH、FOXC2及FOXO1引物序列

注：FOXC2：叉头框蛋白C2；FOXO1：叉头框蛋白O1

1.8 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠体重变化比较

从第9周开始高脂组小鼠体重高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2、图1。

表2 两组小鼠体重变化情况（g，x±s）

图1 两组小鼠体重变化情况

2.2 原代培养的脂肪细胞鉴定

前体脂肪细胞3 h后开始贴壁，贴附后逐渐呈现梭形或不规则三角形。接种4～5 d后，细胞接触并逐渐汇合，形成生长抑制。7～8 d后，细胞内逐渐形成松散的脂滴，脂滴大小不一，最后脂肪滴聚集成葡萄串。2周后，脂肪细胞分化成熟，进行油红O染色。染色显示，增大的脂肪滴将细胞核挤到一边，脂肪滴呈椭圆形或圆形，大部分前脂肪细胞分化成为脂肪细胞。因为油红O与脂肪滴有特异结合的功能，故可鉴定为脂肪细胞。其中未分化的前脂肪细胞和非脂滴聚积的部分不着色。

2.3 Western blot法检测两组皮下和附睾周围来源的脂肪细胞中PAI-1的表达

组内比较，无论高脂组和对照组，附睾周围脂肪组织PAI-1表达均高于皮下脂肪组织，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2、3。

与高脂组皮下脂肪比较，*P < 0.05

图2 两组皮下和附睾周围来源的脂肪细胞中PAI-1表达比较

A：对照组皮下脂肪细胞；B：对照组附睾周围脂肪细胞；C：高脂组皮下脂肪细胞；D：高脂组附睾周围脂肪细胞

图3 两组皮下和附睾周围来源的脂肪细胞中PAI-1蛋白表达条带

2.4 RT-PCR法检测胰岛素干扰前后高脂组脂肪细胞FOXC2和FOXO1 mRNA的表达

结果表明，0.15 μmol/L胰岛素作用6 h前，高脂组皮下脂肪细胞和附睾周围脂肪细胞FOXC2和FOXO1 mRNA的表达均有差异，且差异有统计学意义（P < 0.05）。0.15 μmol/L胰岛素作用6 h后，高脂组皮下脂肪细胞和附睾周围脂肪细胞FOXC2 mRNA的表达都有所升高，FOXO1 mRNA的表达都有所降低，附睾周围脂肪细胞的表达量前后差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3、4，图4、5。

表3 胰岛素作用前后高脂组皮下脂肪细胞和附睾周围脂肪细胞

叉头框蛋白C2 mRNA表达情况（x±s）

注：与胰岛素作用前同部位比较，*P < 0.05

3 讨论

本实验的造模方法与人类的生活方式如高脂肪、高蛋白饮食、缺乏运动所导致的肥胖过程相似，小鼠在连续高脂饮食喂养并限制活动后，体重增加迅速，在第9周，与普通饮食组小鼠比较，差异有统计学意义（P < 0.05），说明本实验高脂饮食喂养可以成功诱导C57BL/6小鼠肥胖。本课题的前期研究结果显示：高脂饮食诱导肥胖大鼠血清胰岛素水平升高，存在高胰岛素血症、胰岛素抵抗[7]。本实验中小鼠存在肥胖和高胰岛素血症。

PAI-1是一种由脂肪组织合成和分泌的细胞因子[8]，主要灭活组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，t-PA），作为纤溶活性的中心环节，PAI-1水平的升高将直接导致纤溶活性受损，与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病及心血管疾病密切相关[9]。脂肪组织PAI-1基因的表达和PAI-1蛋白合成分泌增加。血浆PAI-1水平升高会激活血小板，促进纤维蛋白的沉积并导致血栓形成，也能诱发动脉粥样硬化斑块的产生[6]。因此，血浆PAI-1水平与心血管疾病有着密切的关系。临床研究发现肥胖患者大多伴随有动脉粥样硬化的症状，探讨肥胖与动脉粥样硬化之间的关系，建立两者相关性的分子机制有很重要的意义。本研究显示，高脂饮食造成的肥胖小鼠其内脏和皮下来源脂肪细胞的PAI-1的表达均比正常小鼠升高，差异有统计学意义，说明高脂饮食导致的肥胖小鼠有可能存在着高胰岛素血症，胰岛素进而诱导PAI-1的过表达，与以往文献报道一致[8-10]。早有研究表明，无论肥胖与否，腹部大网膜脂肪细胞PAI-1的表达水平均高于皮下脂肪细胞[10]。本实验结果显示，高脂组内脏脂肪细胞与皮下脂肪细胞表达PAI-1的差异有统计学意义。这与内脏肥胖更容易导致胰岛素抵抗，与糖尿病等疾病的关系更为密切[11]报道相一致。

翼状螺旋叉头转录因子家族的FOXC2和FOXO1在调控胰岛素诱导的PAI-1表达方面发挥重要作用。其调控过程可归纳为：胰岛素刺激FOXC2的表达，而激活的FOXC2通过结合到PAI-1启动子的胰岛素反应原件（insulin response element，IRE）和邻近Smad结合位点的叉头框结合原件（foxhead-binding element，FBE）上调PAI-1表达，在此过程中可能涉及到TGF-β/Smad信号途径[12]。FOXO1则通过抑制TGF-β/Smad信号途径抑制PAI-1表达，但在高胰岛素状态下，由于PI3K/Akt信号通路激活使下游的FOXO1磷酸化而失活，使其失去抑制TGF-β诱导的PAI-1表达[13]；另一方面FOXO1可通过与FOXC2竞争IRE来拮抗FOXC2而调节PAI-1启动子[14]。本实验结果表明，高脂小鼠的附睾周围脂肪细胞表达的FOXC2高于皮下脂肪细胞，在胰岛素作用后，两种来源的脂肪细胞的FOXC2的表达均升高，附睾周围脂肪细胞FOXC2的升高幅度更大，与胰岛素作用前附睾周围脂肪细胞对FOXC2的表达差异有统计学意义。FOXO1在胰岛素作用后，两种来源的脂肪细胞的表达量均有所下降，附睾周围脂肪细胞的表达量下降幅度更大，与胰岛素作用前附睾周围脂肪细胞FOXO1的表达差异有统计学意义。本研究结果可以说明，内脏脂肪细胞对胰岛素的反应性更高，与外周型肥胖相比内脏型肥胖更容易合成并表达PAI-1，也更容易患有糖尿病，心血管等脂类代谢异常的相关疾病。

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（收稿日期：2014-07-28 本文编辑：程 铭）

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（收稿日期：2014-07-28 本文编辑：程 铭）

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（收稿日期：2014-07-28 本文编辑：程 铭）