HPLC法测定益胆胶囊中甘草酸的含量

朱福海

(安徽医科大学第二附属医院药学部，安徽合肥 230601)

益胆胶囊由郁金、金银花、白矾、甘草、硝石、滑石粉、玄参七味中药组成，具有行气散结、清热通淋的作用。用于胆结石、肾结石、膀胱结石、阻塞性黄疸、胆囊炎等病见湿热蕴结之证者。原质量标准中收载的含量测定为HPLC法测定绿原酸的含量，但绿原酸较不稳定，本文在原有标准的基础上采用HPLC法测定益胆胶囊中甘草酸的含量，并进行方法学验证，结果表明本方法简便，专属性强，准确，重复性好，可用于该制剂的质量控制［1－2］。

1 仪器与试药

1.1 试药 甘草酸铵对照品(中国食品药品检定研究院，批号110731－200205，供含量测定用);甲醇(色谱纯);水(重蒸水);其它试剂(分析纯)，益胆胶囊(批号:1207301、1207302、1207303)及阴性制剂均由合肥迪尔医药生物工程有限公司提供。

1.2 仪器 Agilent1100高效液相色谱仪;AD－2型百万分之一电子天平(美国PE公司);BS124S型万分之一电子天平(北京赛多利斯);DL－180J型超声清洗器(上海之信仪器)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 －0.2 mol·L－1醋酸铵溶液 － 冰醋酸(67∶33∶1);检测波长:250 nm;柱温:25℃;流量:1 mL·min－1［3－5］。在此条件下，甘草酸与其它组分能达到基线分离，系统适用性试验理论板数按甘草酸峰计算:n=4 569，不低于2 000。分离度:R=4.88(R ＞1.5)，符合药典规定。拖尾因子:T=0.99(0.95≤T≤1.05)，符合药典规定。供试品中甘草酸所对应的峰保留时间与对照品峰保留时间一致，而阴性空白无干扰。结果见图1。

2.2 对照品溶液的制备 取甘草酸铵对照品约2.5 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，用70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.1036 g·L－1的甘草酸铵对照品溶液(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.020 7)。

2.3 供试品溶液的制备 取本品内容物，研细过四号筛，精密称取1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，具塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率 40 kHz)30 min，取出，放冷，称重，加70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 阴性空白溶液的制备 取缺甘草的阴性样品，按“2.3供试品溶液的制备”项下的方法制备缺甘草阴性空白溶液。

图1 HPLC色谱图

2.5 线性关系考察 分别精密吸取上述甘草酸铵对照品溶液(0.103 6 g·L－1)1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 mL分别置10 mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀。分别吸取20 μL，依次注入液相色谱仪中，依法测定。并以甘草酸的浓度(C)为横坐标，相应的峰面积积分值(A)为纵坐标，得线性回归方程:A=13.175C+7.786 9(r=0.999 9，n=6)，结果表明:甘草酸对照品浓度在 10.15～101.50 mg·L－1范围内呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验 精密吸取供试品溶液20 μL，依法进样，连续测定5次，测得峰面积值为522、536、529、521、524，得峰面积的 RSD 为 1.18%。结果表明本法精密度良好。

2.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液20 μL，分别于制备 0，2，4，6，8 h 后，分别依法进样，测得峰面积值为 532、530、525、519、536，得峰面积的RSD为1.25%。结果表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.8 重现性实验 取同一批样品5份，按“2.3供试品溶液的制备”项下的方法制备溶液，并按“2.1色谱条件”项下色谱条件依法进样20 μL，测定甘草酸含量。结果测得甘草酸含量为 0.52、0.52、0.53、0.53、0.54 mg/粒，即平均含量为 0.53 mg/粒，得甘草酸含量的RSD为1.49%。

2.9 回收率试验 取已知含量样品6份(含甘草酸0.53 mg/粒)，精密称定 0.5 g ，分别置 25 mL 量瓶中，精密加入一定量的甘草酸对照品，按“2.3供试品溶液的制备”项下的方法制备溶液。并按“2.1色谱条件”项下色谱条件依法进样20 μL，测定甘草酸含量。结果见表1。平均回收率97.54%，RSD 0.64%。

表1 回收率测定结果

2.10 样品测定 取三批(批号:1207301、1207302、1207303)，按“2.3供试品溶液的制备”项下的方法制备溶液，并按“2.1色谱条件”项下色谱条件依法进样20 μL，测定甘草酸含量。结果得含量分别为0.43、0.43、0.44 mg/粒。

3 讨论

本实验研究的益胆胶囊，原来选用处方中的金银花活性成分绿原酸为指标成分，为完善益胆胶囊的质量控制标准，另选用处方中的甘草活性三萜类成分甘草酸［6－10］作为增加的含测指标;在色谱条件的选择上，在流动相中添加醋酸－醋酸铵缓冲溶液，以保证甘草酸的稳定性及色谱峰的峰型;同时对甘草酸对照品溶液进行紫外扫描，发现在250 nm处有最大吸收，故选择250 nm作为测定波长，并没有使用2010年药典中的检测波长237 nm。

本实验在制备供试品溶液时，对提取溶媒进行了筛选，分别比较了稀乙醇、甲醇、50%甲醇，70%乙醇及流动相，结果以70%乙醇提取效率高，故在供试品制备过程中使用提70%乙醇作为提取溶媒。

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