水质中细菌总数检验中不确定度评定

王前 佟乃兴 刘烨华（大连华信理化检测中心有限公司）

生活饮用水及其水源水等水体受到生活污水、工农业废水或人和动物粪便的污染后，水中的细菌数量可大量增加，其中病原菌也随之增加，引发传染，危害人类健康，因而水中细菌总数和大肠菌数量可反映水体受微生物污染的程度。水中细菌总数往往同水体受有机物污染的程度呈正相关。故水的细菌学检验对了解水体被污染的程度，在流行病学和提供水质标准中具有重要意义和价值，它是评价水质污染程度的重要指标之一。

我们采用平板计数法，检验水中的细菌总数，细菌总数是指1mL水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数（CFU）。在实验过程中根据相关规定，每次实验必须由同一实验人员，进行平行样测定，因此，我们采用同一阳性水样，做15份平行样，对水质中细菌总数进行平行样评定。但这个过程中一定会存在无法避免的误差，即不确定度，本实验在此对水质中细菌总数检验中不确定度进行评定。

一、实验材料与依据

1.1 测试样品：

以正规采样方法采集的，已确定为阳性的水样。

1.2 实验材料

培养基：营养琼脂（青岛高科园海博生物技术有限公司）

稀释水：超纯水装置制备的纯化水，经121℃，高压灭菌15min，冷却至室温

定量移液管、90cm培养皿、250ml锥形瓶

1.3 实验设备

超净工作台 型号：BCN-1360B，生产厂家：北京东联哈尔仪器制造有限公司

恒温培养箱 型号：HPP-9272，生产厂家：北京东联哈尔仪器制造有限公司

鼓风干燥箱 型号：HPG-9245，生产厂家：北京东联哈尔仪器制造有限公司

高压灭菌锅 型号：ES315，生产厂家：日本Tomy

超纯水装置 型号：611UF，生产厂家：赛多利斯

1.4 实验依据

《水和废水监测分析方法》第四版，细菌总数的测定B（P694），

二、实验方法：

2.1 实验准备

2.2.1 实验前，先将实验用器具用高压灭菌锅以121℃，20min灭菌，并用鼓风干燥箱烘干；

2.2.2 超净工作台无菌操作区域台面，用75%酒精擦拭；实验前紫外照射20mins，开启风机10mins，进行实验操作过程中保持风机开启；

2.2.3 确认实验用仪器设备在检定周期范围内，同时可以正常使用；

2.2.4 确认水样为阳性，同时并确认菌落范围，原水样菌落数超出300，稀释10倍后菌落数在30～300之间；

2.2.5 以无菌操作，准备15份水样。

2.2 实验操作

2.2.1 营养琼脂培养基灭菌后，自然冷却，在温度在50℃左右时，进行实验；

2.2.2 以无菌操作的方式，取1ml水样置于已灭菌的培养皿中，倒入15～20ml，45℃左右的营养琼培养基，立即旋摇（不能将培养基摇到平皿外）充分混匀；一份样品要做平行样对照；

2.2.3 待营养琼脂培养基凝固后，翻转平皿，底面朝上，置于37℃恒温培养箱培养；

2.2.4 培养24小时后，去除平皿，进行菌落计数。

2.3 数据模型

细菌总数=A××fn

式中：A培养后细菌总数 cfu/ml；

fn为样品的稀释倍数；

三、结果与讨论

3.1 稀释倍数不确定度分量：

根据方法要求，取1ml水样加入到9ml无菌水中，以稀释样逐级稀释；此间使用定量移液管，根据校准证书，查看10ml、1ml分度吸管误差可计算标准不确定度分别为u1=±0.05、u2=±0.007；

3.2 菌落数计数不确定度

根据检测方法的要求，培养15份稀释样品平行测定阳性水样结果，进行对数分析：

序号Log值2.031 2.151 2.116 2.100 2.125 2.099 2.111 2.114 2.083 2.035 2.079 2.157 2.130 2.097 2.104 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0平皿1 105 135 125 134 127 125 125 126 117 114 131 134 119 110 136 Log值2.019 2.130 2.097 2.125 2.102 2.097 2.095 2.100 2.068 2.057 2.116 2.125 2.076 2.041 2.132平皿2 108 142 131 126 134 126 129 130 121 109 120 144 135 125 127 11 12 13 14 15 S2 0.00007555 0.00020854 0.00017485 0.00031527 0.00027356 0.00000150 0.00011889 0.00009211 0.00010657 0.00023059 0.00066355 0.00049206 0.00150080 0.00154109 0.00039581

所有菌落数的平均值，A平均=125 cfu/ml。

3.3 合成相对不确定度

3.4 不确定度评定结果

按照方法进行分析测定，扩展不确定度中，取扩展因子K=2，U(C)=10×2=20，即利用平板计数法检验水中细菌总数，不确定度评定结果为细菌总数=125±20 cfu/ml。

[1]国家环境保护总局，水和废水监测分析方法（第四版）[M]，细菌总数的测定（P694），2002：694-697.

[2]JJF 1059-2012，测量不确定度评定与表示[S].