Rab23对鳞状细胞癌Sa3细胞增殖的抑制作用及相关机制

刘曦霖 简强 苗叶 黄敏 李承新

·论著·

Rab23对鳞状细胞癌Sa3细胞增殖的抑制作用及相关机制

刘曦霖 简强 苗叶 黄敏 李承新

目的观察Rab23分子对鳞状细胞癌(简称鳞癌)细胞Sa3增殖的影响及机制。 方法 将鳞状细胞癌Sa3细胞分为4组:正常对照组[转染绿色荧光蛋白(eGFP)]、Rab23过表达组(转染eGFP标记的Rab23过表达质粒)、Rab23沉默组(转染Rab23 shRNA质粒)、Rab23空载体组(转染空载体)。平板克隆形成实验、流式细胞仪检测Rab23过表达和沉默对Sa3细胞增殖能力的影响。Western印迹检测Rab23过表达和沉默对Sa3细胞Erk/p-Erk表达水平的变化。两组间均数比较采用t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析,多组资料两两比较使用Bonferroni's多重比较分析。结果通过构建质粒、慢病毒感染,获得Rab23过表达和Rab23沉默的稳定Sa3细胞株。平板克隆形成实验结果显示,Rab23过表达组克隆形成率为2.3%±0.2%,与正常对照组(3.6%±0.3%)相比,Sa3细胞增殖能力降低(P＜0.05),而Rab23沉默组克隆形成率(4.1%±0.2%)较空载体组(1.8%±0.0%)增殖能力明显提高(P＜0.01)。细胞周期检测显示,Rab23过表达可引起Sa3细胞G1期阻滞,Rab23过表达组增殖指数(0.581±0.035)较正常对照组(0.698±0.018)降低(P＜0.05),而Rab23沉默组增殖指数(0.567±0.015)较空载体组(0.444±0.014)明显提高(P＜0.01)。Western印迹结果显示,与正常对照组相比,Rab23过表达组和Rab23沉默组Sa3细胞Erk表达水平无变化,但Rab23过表达组磷酸化Erk表达水平较正常对照组降低,Rab23沉默组磷酸化Erk表达水平较空载体组升高。结论Rab23对鳞癌Sa3细胞增殖起抑制作用,这种抑制作用可能与Erk通路有关。

Rab23;慢病毒感染;癌,鳞状细胞;细胞系,肿瘤;细胞增殖

皮肤鳞状细胞癌(简称鳞癌)是起源于表皮、皮肤附属器和复层扁平上皮黏膜角质形成细胞的恶性肿瘤,发病率仅次于基底细胞上皮瘤[1],具有侵袭性,可发生早期转移。因此对鳞癌发生发展、侵袭转移的研究具有重要临床意义。Rab23属于小GTP酶超家族Rab家族成员,不仅与脑、骨骼、四肢的发育有关[2],而且具有囊泡转运功能。研究发现,Rab23参与多种肿瘤的发生发展,可促进胃癌[3]、肝癌[4]、肺癌[5]细胞的侵袭,促进肝癌[6]细胞的增殖,抑制乳腺癌细胞的生长[7]。我们前期研究发现,Rab23在鳞癌中高表达,并明显促进鳞癌细胞的侵袭[8],而其对鳞癌细胞生长增殖的影响尚不清楚。本实验通过慢病毒转染技术,建立过表达和干涉Rab23的鳞癌细胞株,研究Rab23对鳞癌细胞增殖的作用及可能机制。

材料和方法

1.材料:慢病毒载体质粒(上海吉凯基因化学技术有限公司),人鳞癌Sa3细胞(日本Reken Cell Bank公司),胎牛血清(北京Solarbio公司),高糖DMEM培养基(美国Hyclone公司),胰酶(美国Sigma公司),嘌呤霉素(德国Merck公司),β肌动蛋白抗体(北京康为世纪生物公司),Rab23抗体(美国Proteintech公司),Erk抗体、磷酸化Erk(p-Erk)抗体(美国Cell signaling公司)。

2.构建稳定的Rab23过表达和沉默的Sa3细胞模型:构建Rab23分子过表达质粒和shRNA质粒,进行慢病毒包装,将包装好的病毒感染人鳞癌Sa3细胞系。试验分为4组:正常对照组[转染绿色荧光蛋白(eGFP)]、Rab23过表达组(转染eGFP标记的 Rab23过表达质粒)、Rab23沉默组[转染Rab23短发卡RNA(shRNA)质粒]、Rab23空载体组(转染空载体)。按照Lentiviral Vector Particle使用操作手册进行感染。将Sa3细胞接种于96孔板,细胞融合度达到70%时,按1×108转导单位(TU)/ml(MOI=100,即病毒 2 μl加入 98 μl含血清 DMEM培养基)加入病毒感染细胞,8～12 h后换成鳞癌细胞常规培养基培养2～3 d,可观察到eGFP荧光。再继续培养1～2周,当荧光表达细胞超过70%时,将细胞种于24孔板,在含嘌呤霉素(1 mg/L)的常规培养基中培养1～2周,得到稳定株。Western印迹检测经慢病毒转染鳞癌Sa3细胞株Rab23的表达水平。

3.平板克隆实验检测Rab23对Sa3细胞增殖能力的影响:无血清培养稳转细胞24 h后,常规消化离心。细胞计数,调整为104个/ml细胞悬液。取200 μl细胞悬液接种6孔板,补加培养液至8 ml,放入孵箱常规培养2周。当出现肉眼可见克隆时弃培养液。磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,甲醇1 ml固定15 min,弃去固定液,加入结晶紫染液1 ml染色15 min,自来水冲洗,空气干燥。计数肉眼可见克隆数,计算克隆形成率。克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。

4.流式细胞仪检测Rab23对Sa3细胞增殖能力的影响:取同步化的稳转细胞常规消化离心,重悬细胞沉淀,调整细胞数为6×106个/ml,预冷的PBS洗3次,加入-20℃预冷的75%乙醇吹打均匀固定。检测前,PBS洗涤2次,沉淀重悬于200 μl PBS,加入Rnase A 37℃水浴1 h,再加入0.5%碘化丙锭染色,4℃避光30 min,上流式细胞仪检测:在488 nm激发波长下测定细胞各周期DNA含量,并计算增殖指数(PI)。PI=S期与G2期细胞比例之和/G1期和S期及G2期细胞比例之和。重复3次。

5.Western印迹检测Sa3细胞Erk、磷酸化Erk表达水平:常规培养稳转细胞,传至3代以上,收集细胞,加入RIPA蛋白裂解液,提取细胞总蛋白,使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量;每泳道按30 μg上样进行蛋白电泳;转0.45 μm硝酸纤维素(NC)膜,恒流300 mA,25 min;5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液封闭1 h,加1∶10 000稀释的兔Erk1/2、p-Erk1/2单克隆抗体和1∶2 000稀释的鼠β肌动蛋白单克隆抗体4℃孵育过夜,1×TBST(TrisbufferedsalineandTween20)缓冲液洗膜,每次15 min,共3次,加1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)-鼠抗人、兔抗人抗体,37℃孵育1 h,1×TBST缓冲液洗膜,使用ECL化学发光试剂盒进行发光。

6.统计学处理:采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析。数据采用±s表示,两组间均数比较使用t检验,多组间均数比较使用单因素方差分析,而多组资料两两比较使用Bonferroni多重比较分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.建立稳定过表达或沉默Rab23的鳞癌Sa3细胞:倒置荧光显微镜观察,转染细胞内可见eGFP荧光,正常对照组、Rab23沉默组、空载体组Rab23分布于胞质中;Rab23过表达组Rab23分布于细胞膜上。Western印迹检测Rab23过表达组、Rab23沉默组转染成功,Rab23沉默组Rab23的表达与空载体组相比下降。见图1。光镜下观察稳转后各组细胞形态,发现与未做任何处理的Sa3细胞相比未发生明显变化。

图1 Western印迹检测Sa3细胞Rab23表达水平 过表达Rab23组融合蛋白转染成功,Rab23沉默组较空载体组相比,Rab23表达水平降低

表1 Rab23对Sa3细胞周期的影响(±s)

表1 Rab23对Sa3细胞周期的影响(±s)

注:n=3

组别 细胞周期(%)G0/G1 G2/M S正常对照组 30.17±1.83 20.46±0.31 49.37±1.78 Rab23过表达组 41.91±3.55 16.90±0.99 41.19±3.22空载体组 55.60±1.36 21.37±1.62 22.83±0.60 Rab23沉默组 43.27±1.48 24.07±1.82 32.66±0.47

2.平板克隆形成实验证实Rab23抑制鳞癌Sa3细胞增殖:Rab23过表达组克隆形成率(2.3%±0.2%)较正常对照组(3.6%±0.3%)降低(t=4.02,P＜0.05),Rab23沉默组(4.1%±0.2%)较空载体组(1.8%±0.0%)明显增高(t=10.00,P＜0.01)。提示Rab23对Sa3细胞增殖具有抑制作用。见图2。

3.流式细胞仪检测显示Rab23抑制鳞癌Sa3细胞的增殖:见表1。Rab23过表达组细胞增殖指数(0.581±0.035)较正常对照组(0.698±0.018)降低(t=2.94,P＜0.05),稳定转染Rab23沉默组(0.567±0.015)较空载体组(0.444±0.014)显著增高(t=6.12,P＜0.01)。表明过表达Rab23可引起Sa3细胞G1期阻滞,影响细胞周期进程。

4.Sa3细胞Erk/p-Erk表达水平:Rab23过表达和Rab23沉默的Sa3细胞Erk蛋白水平较正常对照组和空载体组均无明显变化。与正常对照组相比,Rab23过表达的Sa3细胞p-Erk蛋白水平降低,而Rab23沉默的Sa3细胞p-Erk蛋白水平较空载体组明显增高。见图3。

图3 Western印迹检测Erk/p-Erk表达水平

图2 平板克隆实验检测Rab23对Sa3细胞增殖的影响 Rab23过表达组克隆形成率较正常对照组降低,Rab23沉默组较空载体组增高

讨 论

Eggenschwiler等[9]发现,Rab23是Sonic Hedgehog(Hh)信号通路重要的负调控因子,Rab23作用位点在Hh信号通路的SMO和Gli分子之间,通过组织SMO分子进入纤毛而负调控Hh信号通路[10]。研究发现,在甲状腺癌恶性类型中Rab23的mRNA水平低于滤泡状腺瘤[11];在乳腺癌细胞中,过表达Rab23可降低Hh信号通路的激活状态,并且抑制乳腺癌细胞的增殖[7]。而随着研究的广泛,发现Rab23在不同肿瘤细胞中对生长进程的影响并不一致,甚至呈相反的作用。在胃癌组织中,与非转移型胃癌细胞相比,Rab23显著高表达于转移型胃癌细胞,研究者通过比较基因组杂交和基因表达分析将Rab23确定为胃癌侵袭介导因素;在肝癌组织中,Rab23表现为核阳性,其阳性率与肿瘤尺寸大小成正比,RNA干涉Rab23表达后癌细胞增殖能力下降,说明Rab23可促进肝癌细胞的增殖[6]。

侵袭性研究表明,Rab23促进鳞癌细胞的侵袭[8]。与此同时,Rab23对鳞癌细胞生长增殖的作用尚不清楚,因此我们首先通过慢病毒感染,构建稳定过表达、敲除Rab23的鳞癌Sa3细胞株。细胞周期检测发现,Rab23可以引起鳞癌Sa3细胞G1期阻滞而阻碍细胞周期进程;平板克隆形成实验发现,过表达Rab23组与对照组相比,Sa3细胞增殖水平降低,而敲除Rab23的Sa3细胞增殖能力提高,表明Rab23抑制鳞癌Sa3细胞增殖,这与Rab23对乳腺癌细胞生长的作用一致。

目前研究已明确,Hh信号通路过度激活可引发多种肿瘤。研究者通过免疫组化和原位杂交的方法,已明确在口腔和咽鳞癌[12]、肺鳞癌[5]组织、细胞中发现Hh信号通路的激活,并参与肿瘤的侵袭和生长。MAPK/Erk信号级联反应也是影响多种癌细胞生长增殖的重要信号通路,可被表皮生长因子受体(EGFR)、整合素(integrins)、离子通道等激活。在多种上皮源性恶性肿瘤如头颈部鳞癌细胞中,均有EGFR表达异常,并在鳞癌细胞的生长、侵袭、血管形成中起关键作用[13]。Morozevich等[14]发现,在皮肤鳞癌细胞中,EGFR-Erk通路的激活可促进鳞癌细胞增殖。而最近研究发现,在人髓母细胞瘤细胞中,Hh信号通路和EGFR信号通路存在交互作用[15]。我们初步研究发现,过表达Rab23的Sa3细胞,p-Erk表达水平较对照组降低;敲除Rab23的Sa3细胞,p-Erk表达水平较对照组升高,提示Rab23抑制鳞癌Sa3细胞增殖的机制可能与MAPK/Erk通路相关。而作为Hh信号通路必要的负调控因子,Rab23对鳞癌细胞增殖的抑制作用是单纯通过MAPK/Erk通路还是同时通过Hh与EGFR信号通路有待进一步研究。

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2014-01-16)

(本文编辑:尚淑贤)

Inhibitory effect of Rab23 on the proliferation of a squamous cell carcinoma cell line Sa3 and its mechanisms

Liu Xilin,Jian Qiang,Miao Ye,Huang Min,Li Chengxin.Department of Dermatology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China

Li Chengxin,Email:chengxinderm@163.com

ObjectiveTo evaluate the effect of Rab23 on the proliferation of a squamous cell carcinoma cell line Sa3,and to investigate its mechanisms.MethodsCultured Sa3 cells were classified into four groups:normal control group transfected with green fluorescent protein(GFP),Rab23-overexpressing group transfected with a GFP-labelled Rab23-overexpressing plasmid,Rab23-silencing group transfected with a plasmid carrying a Rab23-targeting shRNA,empty vector group transfected with an empty vector.After additional culture for different durations,plate colony formation assay and flow cytometry were performed to evaluate the proliferative activity of Sa3 cells,and Western blot was conducted to detect the expression of Erk/phosphorylated-Erk in Sa3 cells.Statistical analysis was carried out by t test,one-way analysis of variance and Bonferroni's multiple comparison test.ResultsStable Sa3 cell lines with overexpression or silencing of Rab23 were established by plasmid construction andlentivirus-mediated transfection.The plate colony formation assay showed that the colony formation rate was significantly lower in the Rab23-overexpressing group than in the normal control group(2.3%±0.2%vs.3.6%±0.3%,P＜0.05),but higher in the Rab23-silencing group than in the empty vector group(4.1%±0.2%vs.1.8%±0.03%,P＜0.01).Rab23 overexpression induced G1 phase arrest in Sa3 cells.The proliferation index was significantly decreased in the Rab23-overexpressing group compared with the normal control group(0.581±0.035 vs.0.698±0.018,P＜0.05),but increased in the Rab23-silencing group compared with the empty vector group(0.567±0.015 vs.0.444±0.014,P＜0.01).As Western blot showed,there were no significant changes in the expression of Erk in the Rab23-silencing or-overexpressing group compared with the normal control group,whereas the expression of p-Erk was attenuated in the Rab23-overexpressing group compared with the normal control group,but enhanced in the Rab23-silencing group compared with the empty vector group.ConclusionsRab23 could inhibit the proliferation of Sa3 cells,which may be associated with the Erk pathway.

Rab23;Lentivirus infections;Carcinoma,squamous cell;Cell line,tumor;Cell proliferation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.07.014

710032西安,第四军医大学西京皮肤医院

李承新,Email:chengxinderm@163.com