葛仙米多糖硫酸酯抗凝血活性研究

朱玉婷，袁 杰，杨 洁，田 瑞，曾 智，莫开菊*

(1．湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施445000;2．生物资源保护与利用湖北省重点实验室( 湖北民族学院) ，湖北 恩施445000;3．湖北民族学院 附属民大医院，湖北 恩施445000)

多糖硫酸酯是一类糖链上带有硫酸基的多糖，包括从各种植物或微生物中提取的天然多糖硫酸酯及人工合成的各种多糖硫酸酯．前人研究表明，多糖经硫酸酯化后，其免疫力［1］、抗病毒［2］、抗凝血［3］、抗氧化［4］及抗肿瘤［5］等生物学活性都得到明显的增强，使得硫酸酯化修饰多糖的研究成为多糖研究领域的热点之一．

葛仙米，学名“拟球状念珠藻”(Nostoc spharoidskütz)，属蓝藻门(Cyanopyhta)蓝藻纲(Cyanohpyceae)段殖藻目(Hormogonales)念珠藻科(Nostocaceae)念珠藻属(Nostoc)［6］，古名天仙米、天仙菜，俗称水木耳［7］，与发菜(N． flagelliforme)、地木耳(Nostoc communeVanch)为同属植物，其出现在螺旋藻(Spinclina)之前［8］．世界上葛仙米的分布非常稀少，我国主要分布在湖北省鹤峰县的走马坪镇．另外，非洲等地也有少量的分布．葛仙米中水溶性多糖的提取率达到30%以上［9］．本试验对葛仙米多糖进行硫酸酯化衍生，并对衍生前后的多糖硫酸酯的流变学特性及体外抗凝血活性进行探讨，以期为葛仙米多糖资源的深度开发提供参考．

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

葛仙米多糖及其硫酸酯化产物的样品(自制);血浆:正常人血(由湖北省恩施市湖北民族学院附属民大医院提供);APTT、PT、TT 检测试剂盒(法国STAGO 原装试剂盒，批号分别为107088、107541、107825);试验使用的戊巴比妥、肝素钠、枸橼酸纳及氯化钠等试剂均为分析纯．

1．2 主要仪器

电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司);HH－6 数显恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司);真空干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);低速台式离心机(上海安亭科技仪器厂);血小板及血凝测试仪(法国STAGO);血凝杯(天津普利生科技有限公司)．

1．3 硫酸酯化葛仙米多糖合成［10］

在V(氯磺酸)与V(吡啶)比例为1 ∶6、反应温度60℃、反应时间5 h 的条件下，合成葛仙米多糖硫酸酯(DS=1．01)备用．

在V(氯磺酸)与V(吡啶)比例为1 ∶6、反应温度70℃、反应时间7 h 的条件下，合成葛仙米多糖硫酸酯(DS=0．51)备用．

1．4 用于抗凝血试验的葛仙米多糖及其硫酸酯化样品的配制

用生理盐水分别配制成质量分数为0．2%的葛仙米多糖及其硫酸酯化样品溶液，4℃保存备用．试验时用生理盐水稀释至所需的质量分数．依照文献并结合预试验所得的结果，选用0、5、10、20、40 和80 μg/mL 共6个质量体积比梯度，将肝素钠配成质量体积比为5．04 μg/mL 溶液备用．

1．5 血浆制备

取正常人的静脉血，置于含有1/10 体积0．109 mol/L 枸椽酸钠抗凝剂的塑料离心管中，轻轻颠倒混匀．在3 000 r/min 的条件下离心15 min，取上层贫血小板血浆，分装至离心管中，－20℃冷冻保存备用，使用时37℃孵育．注意血浆样品不能有溶血现象，操作时尽量迅速，临用时37℃恒温水浴融化，5 h 测量相应指标．

1．6 抗凝血参数测定

按仪器使用说明将试剂和质控物放入仪器后，仪器自动进行活化部分凝血活酶时间(activeted partial thromboplasting time，APTT)、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、凝血酶时间(thrombin time ，TT)三个项目的质控分析，检测数据在质控允许范围内方可进行试验，以确保其结果的准确性．然后打开样本抽屉，分别取不同取代度DS(DS=0，DS=0．51，DS=1．01)的葛仙米多糖硫酸酯(浓度分别为0、5、10、20、40、80 μg/mL)溶液0．1 mL 置于小玻璃试管中，然后向各管中加入50 uL 血浆，振荡混匀编辑标本序号，选择APTT、PT、TT 检测项目后按ENTER 键放入样本抽屉，LED 灯亮后确认位置和编号，仪器开始自动检测．

2 结果分析与讨论

2．1 活化部分凝血活酶时间(APTT)的测定

以肝素钠为对照，将葛仙米多糖及其硫酸酯化产物分别进行活化部分凝血活酶时间测试，得到不同取代度及不同浓度产品对APTT 的影响，如图1 所示．

图1 葛仙米多糖及其硫酸酯化产物的部分凝血活酶时间(A:DS=0、B:DS=0．51、C:DS=1．01)Fig．1 APTT of native and sulfated Nostoc Sphaeroides Kützing Polysaccharide(A:DS=0、B:DS=0．51、C:DS=1．01)

由图1 可知，肝素具有极强的延长APTT 的能力，当其浓度增加到5．04 μg/mL 时APTT 是阴性对照(DS=0)的10 倍多，浓度再增加时APTT 超过了仪器的测量范围，可视为血液不凝固．硫酸酯的取代度为1.01(DS=1．01)的样品能显著地延长活化部分凝血活酶时间，并随着浓度的增大，其延长时间迅速增加．在浓度达到4 0μg/mL 时，其延长时间即达180 s 以上，表现出很强的抗凝活性．取代度为0．51(DS=0．51)的硫酸化样品也表现出较强的抗凝血活性，但延长时间明显小于取代度为1.01 的样品．而葛仙米多糖原样(DS=0)基本没有表现出抗凝血活性．延长APTT 凝血时间的机理是样品和内源性凝血因子如Ⅻ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、PK、HMWK 和纤维蛋白原等相互作用，从而阻止血液凝固［11］．各样品的凝血时间都随着样品的浓度增加而显著增加，并且随着硫酸酯取代度的增大其抗凝血活性也增加．由于硫酸基的引入改变了葛仙米多糖的化学组成和空间结构，而导致对内源性凝血因子作用强度的不同，因此表现出的凝血时间也不同．

2．2 血酶时间(TT)测定

以肝素钠为对照，将葛仙米多糖及其硫酸酯化产物分别进行活化部分凝血活酶时间测试，得到不同取代度及不同浓度产品对TT 的影响，如图2 所示．

图2 葛仙米多糖及其硫酸酯化产物的凝血活酶时间(A:DS=0，B:DS=0．51、C:DS=1．01)Fig．2 TT of native and sulfated Nostoc Sphaeroides Kützing Polysaccharide(A:DS=0，B:DS=0．51、C:DS=1．01)

由图2 可知，肝素具有极强的延长TT 的能力，当其浓度增加到2．52 μg/mL 时APTT 是阴性对照(DS=0)的7 倍多，当其浓度增加到5．04 μg/mL 时TT 超过了仪器的测量范围，可视为血液不凝固．随着葛仙米多糖硫酸酯浓度的增加，TT的凝血时间延长．在浓度为40 μg/mL 时，硫酸酯的取代度为1.01(DS=1．01)的样品延长TT 时间即达203．9 s，是阴性对照的13 倍多;取代度为0.51(DS=0.51)的硫酸化样品延长TT时间即达133 s，是阴性对照的8 倍多，明显小于取代度为1.01 的抗凝血活性．在浓度为80 μg/mL 时，硫酸酯的取代度为1.01 和0．51 的硫酸酯化修饰物的凝血时间是阴性对照的12 倍多，与5．04 μg/mL 的肝素达到相同的效果．研究发现样品对TT 的活性与样品中硫酸酯的含量和糖含量的比值有关［11］，比值越大活性越强．TT 是检测样品对凝血酶活性以及血浆纤维蛋白原转变为纤维蛋白能力的过筛试验［12－13］．TT 的延长说明葛仙米多糖硫酸酯能抑制凝血酶和纤维蛋白的聚合．

2．3 凝血酶原时间(PT)测定

以肝素钠为对照，将葛仙米多糖及其硫酸酯化产物分别进行活化部分凝血活酶时间测试，得到不同取代度及不同浓度产品对PT 的影响，如图3 所示．

图3 葛仙米多糖及其硫酸酯化产物的凝血活酶原时间(A:DS=0，B:DS=0．51、C:DS=1．01)Fig．3 PT of native and sulfated Nostoc Sphaeroides Kützing Polysaccharide(A:DS=0，B:DS=0．51、C:DS=1．01)

PT 测定是检测外源凝血系统较为理想和常用的筛选实验．外源性凝血系统又称组织系统凝血，是受伤的组织释放凝血因子Ⅲ，进入血浆，与因子Ⅶ和Ca2+结合形成复合物，可催化因子X 变成活化因子X(Xa)．Xa、V、Ca2+及血小板磷脂共同形成凝血酶原激活物，从而使血液凝固．图3 的试验结果表明:葛仙米多糖及其硫酸酯化产物都没有显著延长PT 时间的效果，这和文献中关于肝素和其他多糖硫酸酯样品类似．Nishio 等［12］研究表明从昆布中提取的褐藻多糖硫酸酯对PT的影响很小．本试验结果显示葛仙米多糖及其硫酸酯化产物，未影响到外源凝血过程中的任何阶段，即对外源凝血途径作用不明显，说明它和肝素具有相似的抗凝血机制．

3 结论

葛仙米多糖本身没有抗凝血活性，而其硫酸酯化产物则具有抗凝血活性．随着硫酸酯取代度的增大，APTT 和TT 也随之延长，并有量效关系，但对PT 的作用不明显．说明其主要是通过抑制内源性凝血过程及共同凝血途径发挥抗凝血作用，对外源凝血途径影响较弱．

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