CRIPTO-1在宫颈鳞癌组织中的表达及临床意义

王培智，李晓娟

(1.河南中医学院科技处，河南 郑州450008;2.河南中医学院基础医学院，河南 郑州450008)

人CRIPTO-1 基因最初在人畸胎癌cDNA 的文库中鉴定出来，因此也被称为畸胎癌来源的生长因子-1，定位于染色体3p21.3［1］。已有研究［2］表明，CRIPTO-1 在多种肿瘤组织中呈现高表达。作者采用免疫组化和原位杂交(in situ hybridization，ISH)方法检测CRIPTO-1 在宫颈鳞癌组织中的表达情况，并分析其表达与宫颈鳞癌临床病理特征之间的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料 90 例宫颈鳞癌、30 例宫颈上皮内瘤变、30 例正常宫颈黏膜组织均来自于2008年5月至2013年8月郑州大学第一附属医院及第二附属医院病理科存档蜡块。患者术前均未服用任何抗肿瘤药物，均未接受放、化疗。90 例宫颈鳞癌患者年龄为28～77 岁，平均(55.8 ±15.3)岁，其中＜50 岁38 例，≥50 岁52 例。依据WHO(1985)肿瘤细胞分化程度标准，其中高分化22 例，中分化43 例，低分化25 例。依据国际妇产科联盟(2000)修订的TNM 分期标准，其中I～Ⅱ期58 例，Ⅲ～Ⅳ期32 例。依据淋巴结情况，其中有淋巴结转移31 例，无淋巴结转移59 例。经40 g·L-1多聚甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，切片厚度4 ～6 μm，用于HE、免疫组化及ISH 染色。

1.2 主要试剂及探针合成 CRIPTO-1 单克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司，S-P 免疫组化试剂盒、DAB 显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。SABio-AP、预杂交液、BCIP/NBT 均购自武汉博士德生物技术有限公司。探针序列:原位杂交5’端生物素标记、全硫代修饰探针均由北京奥科生物技术有限公司合成。CRIPTO-1 探 针 序 列:5’-TCACAGCCGGGTAGAAATGCCTGAGGAAAGCAGCGGA-3’。

1.3 免疫组化 严格按照说明书采用免疫组化S-P法进行CRIPTO-1 蛋白检测。以美国Novus Biologicals公司提供的切片作为阳性对照，以PBS 代替一抗作为阴性对照。

1.4 ISH 方法 组织切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水后，用新鲜配制的体积分数0.5% H2O2室温处理约30 min;用质量分数3% 柠檬酸新鲜配制蛋白酶(0.01 g·L-1)，消化组织标本中DNA 结合蛋白，37 ℃条件下10 min;每张玻片滴加25 μL 不含探针的预杂交液，42 ℃条件下预杂交4 h;加含探针(1 ng·L-1)的杂交液，42 ℃湿盒内杂交12 h;0.1 ×标准柠檬酸盐42 ℃条件下冲洗后，加SA-Bio-AP 37 ℃条件下10 min;漂洗后加BCIP/NBT，避光显色2～4 h。并以不含探针的标本作阴性对照。

1.5 结果判定［3］CRIPTO-1 蛋白和mRNA 阳性信号分别为黄色及紫蓝色颗粒样物质，均位于细胞核及细胞质内。随机选取5 个高倍镜视野，每个视野计数不少于200 个细胞，按阳性细胞所占百分比及着色深浅进行结果判定［8］，采用9 分评分制。按照阳性细胞所占百分比:阳性细胞＜10%为1 分，10% ～50%为2分，＞50%为3 分;按染色程度强弱:阴性为0 分，淡黄(蓝)色染色为1 分，中度黄(蓝)色染色为2 分，棕黄(紫蓝)色染色＜为3 分。然后将2 项评分的乘积作为总分，＜3 分为阴性，≥3 分为阳性。

1.6 统计学处理 应用SPSS 17.0 进行统计分析，阳性率等比较采用χ2检验，相关性分析用Spearman 相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 CRIPTO-1 蛋白表达情况 CRIPTO-1 蛋白阳性表达信号呈不同程度的黄色颗粒样物质，主要位于鳞癌细胞的细胞质(图1)。CRIPTO-1 蛋白在宫颈鳞癌组织中的阳性表达率(65.6%)高于宫颈上皮内瘤变组织(60.0%)及正常宫颈黏膜组织(10. 0%)(χ2=28.571，P ＜0.001)。CRIPTO-1 蛋白过表达与癌的浸润深度、淋巴结转移及TNM 分期均关系密切(χ2分别为10.676、9.718 及11.227;P 均＜0.05)。见表1。

2.2 CRIPTO-1 mRNA 表达情况 CRIPTO-1 mRNA阳性表达信号呈不同程度蓝紫色颗粒样物质，主要位于鳞癌细胞的细胞质(图1)。CRIPTO-1 mRNA 在宫颈鳞癌组织中的阳性表达率(45.6%)高于宫颈上皮内瘤变组织(23.3%)及正常宫颈黏膜组织(10.0%)(χ2=14.577，P=0.001)。CRIPTO-1 mRNA 过表达与癌的浸润深度、淋巴结转移及TNM 分期均关系密切(χ2分别为13.741、4. 720 及30. 170;P 均＜0.05)。见表1。

图1 宫颈鳞癌组织中CRIPTO-1 蛋白(A;S-P，×400)及mRNA(B;ISH，×400)的表达

表1 CRIPTO-1 蛋白和mRNA 表达与宫颈鳞癌临床病理特征的关系

2.3 CRIPTO-1 蛋白及mRNA 在宫颈鳞癌组织中表达的相关性 在宫颈鳞癌组织中，CRIPTO-1 蛋白和mRNA 的表达呈正相关关系(r =0. 287，P ＜0. 05)。见表2。

表2 CRIPTO-1 蛋白及mRNA 表达的相关性

3 讨论

CRIPTO-1 具有癌基因的特性，其在胚胎发育和细胞转化过程中牵涉到许多不同的信号途径［4］，包括Nodal/ALK4/Smad-2 和Glypican-1/c-Src/MAPK/AKT信号途径，并且CRIPTO-1 持续的过表达在许多肿瘤的发生、发展中发挥极其重要的作用［5］。许多研究［6-7］报道CRIPTO-1 在正常黏膜和癌前病变组织中表达不同。此外，CRIPTO-1 的表达在癌前病变组织中显著增加，如结肠腺瘤、胃黏膜的肠上皮生化和乳腺原位导管癌，并且CRIPTO-1 在结肠腺瘤组织中的表达水平是直接与不典型增生的程度、大小和组织学亚型有关的［8］。CRIPTO-1 的表达在高发生率的结肠癌家族的正常结肠黏膜标本中有62%可被检测到，但低风险患者的标本中仅20%结肠腺瘤检出CRIPTO-1 的阳性表达［9］。

本文结果显示，CRIPTO-1 在宫颈鳞癌及宫颈上皮内瘤变组织中的表达则均存在一定程度的升高，且CRIPTO-1 蛋白及mRNA 过表达与宫颈鳞癌的浸润深度、淋巴结转移及TNM 分期有关，这就提示CRIPTO-1蛋白及mRNA 的过表达可能与肿瘤的发生、发展、浸润、转移及进展过程有密切的关系。此外，宫颈鳞癌组织中CRIPTO-1 蛋白的表达与CRIPTO-1 mRNA 的表达呈正相关，提示两者表达具有一致性，联合检测有助于正确评估患者的病情进展，给临床治疗方案的制定提供一定的参考依据。

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