Bax/Bcl—2在淋巴回流障碍大鼠肾组织中的表达

张桃艳++++++李德祥+++++柳刚++++关广聚

[摘要] 目的 探讨阻断肾淋巴循环对大鼠肾脏细胞Bax、Bcl-2表达的影响及与大鼠肾脏功能的关系。 方法 选取雄性Wistar大鼠48只，将其随机分为模型组和对照组，各24只。各组大鼠分别于术后第1、7、14、28天各处死6只，留取肾组织标本提取组织蛋白、mRNA和制作石蜡切片。运用Real-time PCR、Western blot和免疫组织化学检测Bax、Bcl-2在肾组织中的表达，并测定24 h尿蛋白和血肌酐水平。 结果 模型组大鼠的肾功能逐渐减退，随着术后时间的延长，肾功能损害逐渐加重。模型组大鼠的Bax表达明显强于对照组，免疫组织化学显示，Bax的表达主要在肾小管及肾间质，远端小管的表达尤其明显，相反，模型组大鼠的Bcl-2的表达明显减弱。 结论 阻断肾淋巴循环可导致大鼠肾功能及肾小管间质的损害，并随时间延长而加重，肾细胞凋亡与此密切相关，其中Bax/Bcl-2途径发挥了积极作用。

[关键词] 淋巴循环；尿蛋白；血肌酐；Bax/Bcl-2

[中图分类号] R692.6 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）11（a）-0004-05

国际肾病学会发布的最新权威数据表明，慢性肾脏病在成人中的发生率约为10%，年龄越大发病率越高。在慢性肾脏病的形成过程中，细胞凋亡在其中的作用越来越受到大家的瞩目[1-2]。细胞凋亡又称程序性的细胞死亡，一直是国内外学者研究的热点。研究表明，凋亡可以导致肾脏细胞减少，导致肾脏功能障碍。在某些肾脏疾病模型中，如IgA肾病、红斑狼疮性肾炎等，肾小球硬化、肾脏功能的损害与肾小球细胞的凋亡密切相关。另外，肾小管及肾间质细胞的凋亡也可导致肾囊肿和肾纤维化的发生[3]。有研究表明，在5/6肾切除大鼠模型中，肾小球的硬化和肾小管萎缩、消失与肾小球内皮细胞的凋亡密不可分[4]。近年来发现，Bcl-2 家族是在细胞凋亡中有重要作用的一类蛋白质，在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要作用，而Bcl-2 和Bax 分别是此家族中最有代表性的抑制凋亡和促进凋亡基因[5]。本课题在损害肾淋巴循环基础上研究凋亡是否参与了其中的发病过程，Bax/Bcl-2在此过程中的表达又如何？从而为临床上慢性肾脏病的发生寻找新的证据。1 材料与方法1.1 实验动物分组与模型制作雄性Wistar大鼠48只，体重180～200 g（山东大学实验动物中心提供）。所有大鼠按照随机原则分为两组：对照组和模型组各24只。对照组大鼠经3%水合氯醛（1 ml/100 g）腹腔麻醉，分离出肾脏后切除右肾，模型组大鼠在此基础上再结扎左肾淋巴管，方法参考Wilcox等[6-7]，即在肾被膜下及肾实质内注射0.5 ml 2% Evans蓝，显示清楚淋巴管后在外科手术显微镜下用4号线结扎左肾肾门淋巴管，并结扎左肾上下极脂肪纤维组织以阻断被膜下淋巴循环。各组大鼠分别于术后第1、7、14、28天各处死6只。1.2 标本留取 所有大鼠于处死前1 d开始留取24 h尿液，以测尿蛋白。处死过程中心脏取血测血肌酐。肾脏组织经过充分灌洗后，分为两部分，一部分用于免疫组织化学；另一部分用于Western blot和Real-time PCR。1.3 免疫组织化学检测肾脏组织经常规脱蜡、水化，然后切片，用3% H2O2封闭，再经微波修复后滴加Ⅰ抗（Bax工作浓度为1∶50，Bcl-2工作浓度为1∶1000。 Biosciences Pharmingen USA），放于4 ℃冷藏过夜。加入Ⅱ抗山羊抗兔IgG抗体（购自武汉博士德生物公司）。经DAB显色、苏木素复染后，再按常规方法脱水、封片等，最后置于显微镜下观察结果。所有实验均设阴性对照，以PBS代替Ⅰ抗。本实验中所用免疫组织化学试剂盒等购自北京中杉生物公司。1.4 Western blot检测过程根据组织总蛋白提取试剂盒（购自申能博彩公司）说明方法提取大鼠肾脏总蛋白，然后用BCA法测定组织蛋白浓度。经过灌胶、电泳、转膜、牛奶封闭等过程后，加Ⅰ抗（Ⅰ抗浓度Bax 1∶1000，Bcl-2 1∶1000，β-actin单抗1∶5000）4 ℃冷藏过夜。加Ⅱ抗（1∶2500），室温放置1 h。然后根据ECL试剂盒（购自 Santa Cruz公司）说明在胶片上曝光及定影等，最后测定各蛋白带的灰度值，所有目的蛋白带的灰度值与与β-actin的灰度值进行比较，其比值就是各目的蛋白表达的丰度。1.5 Real-time PCR的检测过程取肾组织50 mg左右，按Trizol试剂盒（Invitrogen公司）说明抽提mRNA。并反转录成cDNA（试剂盒TaKaRa公司）。采用ABI PRISM 7000 HT进行Real-time PCR。引物序列（TaKaRa公司设计，上海生物化工有限公司合成）见表1。荧光Real-time PCR采取两步法PCR程序：首先95℃预变性10 s，然后进行PCR反应，95℃ 5 s、60℃ 31 s，经过40个循环。两组间的比较应用Folds=2-ΔΔCt公式[8]进行分析。表1 引物序列1.6 统计学处理 数据采用SPSS 11.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用方差检验与单因素分析，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果2.1 两组大鼠术后第1、7、14、28 天尿蛋白、血肌酐水平的比较 模型组大鼠的尿蛋白于术后第7天即出现明显变化（P<0.05），手术时间越长，肾功能损害越明显。模型组术后第14、28天的尿蛋白水平与同组第7天比较，差异有统计学意义（P<0.05），与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。同样，血肌酐水平变化类似于尿蛋白，模型组大鼠的血肌酐水平在术后第7天开始出现明显变化，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），手术时间越长，肾功能损害越明显。模型组第14天的血肌酐水平与同组第7天比较，差异有统计学意义（P<0.05），与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）（表2）。表2 两组大鼠术后第1、7、14、28 天尿蛋白、血肌酐水平的比较（x±s） 与同组第7天比较，*P<0.05；与对照组同时间比较，#P <0.05，▲P<0.01 2.2 两组大鼠肾组织Bax、Bcl-2的表达（免疫组织化学）对照组大鼠肾组织Bax的表达非常微弱，而模型组大鼠肾组织的Bax表达非常显著，主要的表达部位在肾小管及肾间质，远端小管的表达尤其强烈。Bcl-2表达正好相反，对照组大鼠有明显的Bcl-2表达，其主要部位也在肾小管和肾间质，模型组大鼠Bcl-2的表达却非常微弱（图1）。图1 两组大鼠肾组织Bax、Bcl-2蛋白的表达（免疫组织化学×200）2.3 两组大鼠肾组织Bax、Bcl-2蛋白表达的比较（Western blot）Western blot分析更能说明Bax、Bcl-2蛋白在两组大鼠间的不同表达。阻断肾淋巴循环后，模型组大鼠Bax蛋白的表达量明显增加，这与免疫组织化学观察到的现象基本吻合。在术后第14天，模型组大鼠Bax的蛋白量就达到顶峰（P<0.01），以后维持逐渐增高现象，而凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达从术后第1天就出现下降趋势，Bax/Bcl-2比值明显增高。对照组 Bax的表达非常微弱，相反Bcl-2的表达明显，与模型组正好相反。在整个术后过程中，对照组Bax、Bcl-2的表达基本无明显变化（图2）。2.4 两组大鼠肾组织Bax、Bcl-2 mRNA表达的比较（Real-time PCR）Real-time PCR 从基因水平反映了两组大鼠Bax、Bcl-2的表达情况。实验显示，模型组大鼠Bax的 mRNA表达在所有时间段均呈显著增高趋势，其中高峰期在第7天，而Bcl-2 mRNA表达却呈明显下降（P<0.05），随着术后时间的延长而呈稳步下降的趋势。模型组Bax/Bcl-2 mRNA比值于术后第14天达到高峰（P<0.01），与对照组比较明显增高。相反，对照组不管是Bax还是Bcl-2 ，此两者的表达基本无明显变化（图3）。3 讨论无论健康或疾病状态下，淋巴循环都有其重要的作用，遗憾的是，它的功能至今仍未清楚阐明，甚至被忽略。淋巴循环将间质多余水分带回血液，把抗原和免疫活性细胞带到炎症部位的淋巴结。传统观点认为淋巴系统只是被动的执行这些功能，如今随着淋巴分子机制进一步研究发展，这种观点正受到挑战。近年来，器官功能障碍与其淋巴循环的关系逐渐成为研究热点，但尚未达成共识。有报道称，淋巴循环障碍对组织影响甚微[9]，但也有研究表明，阻断肾脏的淋巴循环可以导致肾脏硬化[10]。本实验就针对肾脏淋巴循环和肾脏功能的关系进行了再次探索与研究。结果表明，当阻断大鼠的肾脏淋巴循环后，大鼠的肾脏功能随之出现变化。模型组大鼠的尿蛋白及血肌酐水平随着术后时间的延长而不断升高。本实验中免疫组织化学结果提示，阻断肾脏的淋巴循环，其影响最明显的是肾小管及肾间质，由此可见，淋巴循环障碍对肾功能的影响是明显的，这就为临床上原因不明的慢性肾脏病，尤其慢性肾小管及肾间质病变提供了新的诊断思路。本研究结果提示，淋巴循环障碍不但损害肾脏功能，并且在此基础上，有关于凋亡的相关基因Bax/Bcl-2的表达也出现明显变化，这为探讨肾脏损伤机制提供了新的线索。众所周知，Bax/Bcl-2在凋亡中的重要作用，其与凋亡的关系一直是近年来研究的热点[11-12]。Bcl-2 家族中Bax是促进凋亡的重要蛋白，与此相反，Bcl-2却是抑制细胞凋亡的蛋白，两者的作用正好相反，因此两者的比值变化往往决定凋亡的发生与否[13-15]。近年来的研究表明，肾细胞的凋亡与Bax/Bcl-2的比值密切相关。提高凋亡促进因子Bax与凋亡抑制因子Bcl-2 的比值，对肾小管萎缩、肾纤维化样的凋亡进程有明显的促进作用[16]。本实验的研究结果证实了这一点。Western blot从蛋白水平反映了模型组大鼠的Bax表达明显增加，尤其在术后14 d就达到高峰。Real-time PCR从基因水平反映了模型组大鼠的Bax表达加强，并且在所有时间段均呈显著增高趋势，而与此形成明显对比的是，Bcl-2表达均成下降趋势。模型组大鼠的Bax/Bcl-2比值明显增高。阻断肾脏的淋巴循环可以引起肾功能减退，此结果与凋亡基因表达的失衡密切相关。由此可以推断，肾脏细胞的凋亡是淋巴循环障碍导致肾功能衰退的重要原因之一。淋巴循环障碍对于肾脏的损害可能不仅限于此，本研究仅揭示了Bax/Bcl-2途径的变化，那么在肾淋巴循环障碍过程中，是否还存在其他病理机制，尚待进一步研究、探索。[参考文献][1] Kitamura H，Shimizu A，Masuda Y，et al.Apoptosis in glomerular endothelial cells during the development of glomerulosclerosis in the remnant kidney model[J].Exp Nephrol，1998，6（4）：328-336.[2] Zhang N，Cheng GY，Liu XZ，et al.Expression of Bcl-2 and NF-κB in brain tissue after acute renal ischemia-reperfusion in rats[J].Asian Pac J Trop Med，2014，7（5）：386-389. [3] 段惠军，史永宏，张艳玲，等.肾切除大鼠残肾细胞凋亡及凋亡相关基因的表达[J].中华物理医学与康复杂志，2001，23（5）：309-311.[4] Nankivell BJ，Borrows RJ，Fung CL，et al.The natural history of chronic allograft nephropathy[J].N Engl J Med，2003， 349（24）：2326-2333.[5] Sabirzhanov B，Zhao Z，Stoica BA，et al.Downregulation of miR-23a and miR-27a following experimental traumatic brain injury induces neuronal cell death through activation of proapoptotic Bcl-2 proteins[J].J Neurosci，2014，34（30）：10055-10071. [6] Wilcox CS，Sterzel RB，Dunckel PT，et al.Renal interstitial pressure and sodium excretion during hilar lymphatic ligation[J].Am J Physiol，1984，247（2 Pt 2）：F344-F351.[7] Stolarczyk J，Carone FA.Effects of renal lymphatic occlusion and venous constriction on renal function[J].Am J Pathol，1975，78（2）： 285-296. [8] Kitamura H，Shimizu A，Masuda Y，et al.Apoptosis in glomerular endothelial cells during the development of glomerulosclerosis in the remnant kidney model[J].Exp Nephrol，1998，6（4）：328-336.[9] 孙旭海，郭延章，王秀中，等.破坏肾淋巴循环对犬自体移植肾组织学的影响[J].第四军医大学学报，2003，24（10）：958-959.[10] Mironov AA，Eremin GA，Vasilenko VA，et al.Changes in kidney tissue elements after ligation of the lymphatic vessels.Role of disorders of lymph outflow after kidney transplantation[J].Arkh Anat Gistol Embriol，1980，79（10）：80-89.[11] Zagorodna O，Martin SM，Rutkowski DT，et al.2-deoxyglucose-induced toxicity is regulated by Bcl-2 family members and is enhanced by antagonizing Bcl-2 in lymphoma cell lines[J].Oncogene，2012，31（22）：2738-2749.[12] Sun Y，Lin Y，Li H，et al.2，5-Hexanedione induces human ovarian granulosa cell apoptosis through BCL-2，BAX，and CASPASE-3 signaling pathways[J].Arch Toxicol，2012，86（2）：205-215.[13] Lalier L，Cartron PF，Juin P，et al.Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis[J].Apoptosis，2007， 12（5）：887-896.[14] Gill MB，Perez-Polo JR.Bax shuttling after rotenone treatment of neuronal primary cultures：effects on cell death phenotypes[J].J Neurosci Res，2009，87（9）：2047-2065. [15] Lee do Y，Lee KS，Lee HJ，et al.Kynurenic acid attenuates MPP（+）-induced dopaminergic neuronal cell death via a Bax-mediated mitochondrial pathway[J].Eur J Cell Biol，2008，87（6）：389-397.[16] Rossé T，Olivier R， Monney L，et al.Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome c[J].Nature，1998，391（6666）： 496-499.（收稿日期：2014-08-26 本文编辑：许俊琴）

[摘要] 目的 探讨阻断肾淋巴循环对大鼠肾脏细胞Bax、Bcl-2表达的影响及与大鼠肾脏功能的关系。 方法 选取雄性Wistar大鼠48只，将其随机分为模型组和对照组，各24只。各组大鼠分别于术后第1、7、14、28天各处死6只，留取肾组织标本提取组织蛋白、mRNA和制作石蜡切片。运用Real-time PCR、Western blot和免疫组织化学检测Bax、Bcl-2在肾组织中的表达，并测定24 h尿蛋白和血肌酐水平。 结果 模型组大鼠的肾功能逐渐减退，随着术后时间的延长，肾功能损害逐渐加重。模型组大鼠的Bax表达明显强于对照组，免疫组织化学显示，Bax的表达主要在肾小管及肾间质，远端小管的表达尤其明显，相反，模型组大鼠的Bcl-2的表达明显减弱。 结论 阻断肾淋巴循环可导致大鼠肾功能及肾小管间质的损害，并随时间延长而加重，肾细胞凋亡与此密切相关，其中Bax/Bcl-2途径发挥了积极作用。

[关键词] 淋巴循环；尿蛋白；血肌酐；Bax/Bcl-2

[中图分类号] R692.6 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）11（a）-0004-05

国际肾病学会发布的最新权威数据表明，慢性肾脏病在成人中的发生率约为10%，年龄越大发病率越高。在慢性肾脏病的形成过程中，细胞凋亡在其中的作用越来越受到大家的瞩目[1-2]。细胞凋亡又称程序性的细胞死亡，一直是国内外学者研究的热点。研究表明，凋亡可以导致肾脏细胞减少，导致肾脏功能障碍。在某些肾脏疾病模型中，如IgA肾病、红斑狼疮性肾炎等，肾小球硬化、肾脏功能的损害与肾小球细胞的凋亡密切相关。另外，肾小管及肾间质细胞的凋亡也可导致肾囊肿和肾纤维化的发生[3]。有研究表明，在5/6肾切除大鼠模型中，肾小球的硬化和肾小管萎缩、消失与肾小球内皮细胞的凋亡密不可分[4]。近年来发现，Bcl-2 家族是在细胞凋亡中有重要作用的一类蛋白质，在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要作用，而Bcl-2 和Bax 分别是此家族中最有代表性的抑制凋亡和促进凋亡基因[5]。本课题在损害肾淋巴循环基础上研究凋亡是否参与了其中的发病过程，Bax/Bcl-2在此过程中的表达又如何？从而为临床上慢性肾脏病的发生寻找新的证据。1 材料与方法1.1 实验动物分组与模型制作雄性Wistar大鼠48只，体重180～200 g（山东大学实验动物中心提供）。所有大鼠按照随机原则分为两组：对照组和模型组各24只。对照组大鼠经3%水合氯醛（1 ml/100 g）腹腔麻醉，分离出肾脏后切除右肾，模型组大鼠在此基础上再结扎左肾淋巴管，方法参考Wilcox等[6-7]，即在肾被膜下及肾实质内注射0.5 ml 2% Evans蓝，显示清楚淋巴管后在外科手术显微镜下用4号线结扎左肾肾门淋巴管，并结扎左肾上下极脂肪纤维组织以阻断被膜下淋巴循环。各组大鼠分别于术后第1、7、14、28天各处死6只。1.2 标本留取 所有大鼠于处死前1 d开始留取24 h尿液，以测尿蛋白。处死过程中心脏取血测血肌酐。肾脏组织经过充分灌洗后，分为两部分，一部分用于免疫组织化学；另一部分用于Western blot和Real-time PCR。1.3 免疫组织化学检测肾脏组织经常规脱蜡、水化，然后切片，用3% H2O2封闭，再经微波修复后滴加Ⅰ抗（Bax工作浓度为1∶50，Bcl-2工作浓度为1∶1000。 Biosciences Pharmingen USA），放于4 ℃冷藏过夜。加入Ⅱ抗山羊抗兔IgG抗体（购自武汉博士德生物公司）。经DAB显色、苏木素复染后，再按常规方法脱水、封片等，最后置于显微镜下观察结果。所有实验均设阴性对照，以PBS代替Ⅰ抗。本实验中所用免疫组织化学试剂盒等购自北京中杉生物公司。1.4 Western blot检测过程根据组织总蛋白提取试剂盒（购自申能博彩公司）说明方法提取大鼠肾脏总蛋白，然后用BCA法测定组织蛋白浓度。经过灌胶、电泳、转膜、牛奶封闭等过程后，加Ⅰ抗（Ⅰ抗浓度Bax 1∶1000，Bcl-2 1∶1000，β-actin单抗1∶5000）4 ℃冷藏过夜。加Ⅱ抗（1∶2500），室温放置1 h。然后根据ECL试剂盒（购自 Santa Cruz公司）说明在胶片上曝光及定影等，最后测定各蛋白带的灰度值，所有目的蛋白带的灰度值与与β-actin的灰度值进行比较，其比值就是各目的蛋白表达的丰度。1.5 Real-time PCR的检测过程取肾组织50 mg左右，按Trizol试剂盒（Invitrogen公司）说明抽提mRNA。并反转录成cDNA（试剂盒TaKaRa公司）。采用ABI PRISM 7000 HT进行Real-time PCR。引物序列（TaKaRa公司设计，上海生物化工有限公司合成）见表1。荧光Real-time PCR采取两步法PCR程序：首先95℃预变性10 s，然后进行PCR反应，95℃ 5 s、60℃ 31 s，经过40个循环。两组间的比较应用Folds=2-ΔΔCt公式[8]进行分析。表1 引物序列1.6 统计学处理 数据采用SPSS 11.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用方差检验与单因素分析，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果2.1 两组大鼠术后第1、7、14、28 天尿蛋白、血肌酐水平的比较 模型组大鼠的尿蛋白于术后第7天即出现明显变化（P<0.05），手术时间越长，肾功能损害越明显。模型组术后第14、28天的尿蛋白水平与同组第7天比较，差异有统计学意义（P<0.05），与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。同样，血肌酐水平变化类似于尿蛋白，模型组大鼠的血肌酐水平在术后第7天开始出现明显变化，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），手术时间越长，肾功能损害越明显。模型组第14天的血肌酐水平与同组第7天比较，差异有统计学意义（P<0.05），与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）（表2）。表2 两组大鼠术后第1、7、14、28 天尿蛋白、血肌酐水平的比较（x±s） 与同组第7天比较，*P<0.05；与对照组同时间比较，#P <0.05，▲P<0.01 2.2 两组大鼠肾组织Bax、Bcl-2的表达（免疫组织化学）对照组大鼠肾组织Bax的表达非常微弱，而模型组大鼠肾组织的Bax表达非常显著，主要的表达部位在肾小管及肾间质，远端小管的表达尤其强烈。Bcl-2表达正好相反，对照组大鼠有明显的Bcl-2表达，其主要部位也在肾小管和肾间质，模型组大鼠Bcl-2的表达却非常微弱（图1）。图1 两组大鼠肾组织Bax、Bcl-2蛋白的表达（免疫组织化学×200）2.3 两组大鼠肾组织Bax、Bcl-2蛋白表达的比较（Western blot）Western blot分析更能说明Bax、Bcl-2蛋白在两组大鼠间的不同表达。阻断肾淋巴循环后，模型组大鼠Bax蛋白的表达量明显增加，这与免疫组织化学观察到的现象基本吻合。在术后第14天，模型组大鼠Bax的蛋白量就达到顶峰（P<0.01），以后维持逐渐增高现象，而凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达从术后第1天就出现下降趋势，Bax/Bcl-2比值明显增高。对照组 Bax的表达非常微弱，相反Bcl-2的表达明显，与模型组正好相反。在整个术后过程中，对照组Bax、Bcl-2的表达基本无明显变化（图2）。2.4 两组大鼠肾组织Bax、Bcl-2 mRNA表达的比较（Real-time PCR）Real-time PCR 从基因水平反映了两组大鼠Bax、Bcl-2的表达情况。实验显示，模型组大鼠Bax的 mRNA表达在所有时间段均呈显著增高趋势，其中高峰期在第7天，而Bcl-2 mRNA表达却呈明显下降（P<0.05），随着术后时间的延长而呈稳步下降的趋势。模型组Bax/Bcl-2 mRNA比值于术后第14天达到高峰（P<0.01），与对照组比较明显增高。相反，对照组不管是Bax还是Bcl-2 ，此两者的表达基本无明显变化（图3）。3 讨论无论健康或疾病状态下，淋巴循环都有其重要的作用，遗憾的是，它的功能至今仍未清楚阐明，甚至被忽略。淋巴循环将间质多余水分带回血液，把抗原和免疫活性细胞带到炎症部位的淋巴结。传统观点认为淋巴系统只是被动的执行这些功能，如今随着淋巴分子机制进一步研究发展，这种观点正受到挑战。近年来，器官功能障碍与其淋巴循环的关系逐渐成为研究热点，但尚未达成共识。有报道称，淋巴循环障碍对组织影响甚微[9]，但也有研究表明，阻断肾脏的淋巴循环可以导致肾脏硬化[10]。本实验就针对肾脏淋巴循环和肾脏功能的关系进行了再次探索与研究。结果表明，当阻断大鼠的肾脏淋巴循环后，大鼠的肾脏功能随之出现变化。模型组大鼠的尿蛋白及血肌酐水平随着术后时间的延长而不断升高。本实验中免疫组织化学结果提示，阻断肾脏的淋巴循环，其影响最明显的是肾小管及肾间质，由此可见，淋巴循环障碍对肾功能的影响是明显的，这就为临床上原因不明的慢性肾脏病，尤其慢性肾小管及肾间质病变提供了新的诊断思路。本研究结果提示，淋巴循环障碍不但损害肾脏功能，并且在此基础上，有关于凋亡的相关基因Bax/Bcl-2的表达也出现明显变化，这为探讨肾脏损伤机制提供了新的线索。众所周知，Bax/Bcl-2在凋亡中的重要作用，其与凋亡的关系一直是近年来研究的热点[11-12]。Bcl-2 家族中Bax是促进凋亡的重要蛋白，与此相反，Bcl-2却是抑制细胞凋亡的蛋白，两者的作用正好相反，因此两者的比值变化往往决定凋亡的发生与否[13-15]。近年来的研究表明，肾细胞的凋亡与Bax/Bcl-2的比值密切相关。提高凋亡促进因子Bax与凋亡抑制因子Bcl-2 的比值，对肾小管萎缩、肾纤维化样的凋亡进程有明显的促进作用[16]。本实验的研究结果证实了这一点。Western blot从蛋白水平反映了模型组大鼠的Bax表达明显增加，尤其在术后14 d就达到高峰。Real-time PCR从基因水平反映了模型组大鼠的Bax表达加强，并且在所有时间段均呈显著增高趋势，而与此形成明显对比的是，Bcl-2表达均成下降趋势。模型组大鼠的Bax/Bcl-2比值明显增高。阻断肾脏的淋巴循环可以引起肾功能减退，此结果与凋亡基因表达的失衡密切相关。由此可以推断，肾脏细胞的凋亡是淋巴循环障碍导致肾功能衰退的重要原因之一。淋巴循环障碍对于肾脏的损害可能不仅限于此，本研究仅揭示了Bax/Bcl-2途径的变化，那么在肾淋巴循环障碍过程中，是否还存在其他病理机制，尚待进一步研究、探索。[参考文献][1] Kitamura H，Shimizu A，Masuda Y，et al.Apoptosis in glomerular endothelial cells during the development of glomerulosclerosis in the remnant kidney model[J].Exp Nephrol，1998，6（4）：328-336.[2] Zhang N，Cheng GY，Liu XZ，et al.Expression of Bcl-2 and NF-κB in brain tissue after acute renal ischemia-reperfusion in rats[J].Asian Pac J Trop Med，2014，7（5）：386-389. [3] 段惠军，史永宏，张艳玲，等.肾切除大鼠残肾细胞凋亡及凋亡相关基因的表达[J].中华物理医学与康复杂志，2001，23（5）：309-311.[4] Nankivell BJ，Borrows RJ，Fung CL，et al.The natural history of chronic allograft nephropathy[J].N Engl J Med，2003， 349（24）：2326-2333.[5] Sabirzhanov B，Zhao Z，Stoica BA，et al.Downregulation of miR-23a and miR-27a following experimental traumatic brain injury induces neuronal cell death through activation of proapoptotic Bcl-2 proteins[J].J Neurosci，2014，34（30）：10055-10071. [6] Wilcox CS，Sterzel RB，Dunckel PT，et al.Renal interstitial pressure and sodium excretion during hilar lymphatic ligation[J].Am J Physiol，1984，247（2 Pt 2）：F344-F351.[7] Stolarczyk J，Carone FA.Effects of renal lymphatic occlusion and venous constriction on renal function[J].Am J Pathol，1975，78（2）： 285-296. [8] Kitamura H，Shimizu A，Masuda Y，et al.Apoptosis in glomerular endothelial cells during the development of glomerulosclerosis in the remnant kidney model[J].Exp Nephrol，1998，6（4）：328-336.[9] 孙旭海，郭延章，王秀中，等.破坏肾淋巴循环对犬自体移植肾组织学的影响[J].第四军医大学学报，2003，24（10）：958-959.[10] Mironov AA，Eremin GA，Vasilenko VA，et al.Changes in kidney tissue elements after ligation of the lymphatic vessels.Role of disorders of lymph outflow after kidney transplantation[J].Arkh Anat Gistol Embriol，1980，79（10）：80-89.[11] Zagorodna O，Martin SM，Rutkowski DT，et al.2-deoxyglucose-induced toxicity is regulated by Bcl-2 family members and is enhanced by antagonizing Bcl-2 in lymphoma cell lines[J].Oncogene，2012，31（22）：2738-2749.[12] Sun Y，Lin Y，Li H，et al.2，5-Hexanedione induces human ovarian granulosa cell apoptosis through BCL-2，BAX，and CASPASE-3 signaling pathways[J].Arch Toxicol，2012，86（2）：205-215.[13] Lalier L，Cartron PF，Juin P，et al.Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis[J].Apoptosis，2007， 12（5）：887-896.[14] Gill MB，Perez-Polo JR.Bax shuttling after rotenone treatment of neuronal primary cultures：effects on cell death phenotypes[J].J Neurosci Res，2009，87（9）：2047-2065. [15] Lee do Y，Lee KS，Lee HJ，et al.Kynurenic acid attenuates MPP（+）-induced dopaminergic neuronal cell death via a Bax-mediated mitochondrial pathway[J].Eur J Cell Biol，2008，87（6）：389-397.[16] Rossé T，Olivier R， Monney L，et al.Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome c[J].Nature，1998，391（6666）： 496-499.（收稿日期：2014-08-26 本文编辑：许俊琴）

[摘要] 目的 探讨阻断肾淋巴循环对大鼠肾脏细胞Bax、Bcl-2表达的影响及与大鼠肾脏功能的关系。 方法 选取雄性Wistar大鼠48只，将其随机分为模型组和对照组，各24只。各组大鼠分别于术后第1、7、14、28天各处死6只，留取肾组织标本提取组织蛋白、mRNA和制作石蜡切片。运用Real-time PCR、Western blot和免疫组织化学检测Bax、Bcl-2在肾组织中的表达，并测定24 h尿蛋白和血肌酐水平。 结果 模型组大鼠的肾功能逐渐减退，随着术后时间的延长，肾功能损害逐渐加重。模型组大鼠的Bax表达明显强于对照组，免疫组织化学显示，Bax的表达主要在肾小管及肾间质，远端小管的表达尤其明显，相反，模型组大鼠的Bcl-2的表达明显减弱。 结论 阻断肾淋巴循环可导致大鼠肾功能及肾小管间质的损害，并随时间延长而加重，肾细胞凋亡与此密切相关，其中Bax/Bcl-2途径发挥了积极作用。

[关键词] 淋巴循环；尿蛋白；血肌酐；Bax/Bcl-2

[中图分类号] R692.6 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）11（a）-0004-05

国际肾病学会发布的最新权威数据表明，慢性肾脏病在成人中的发生率约为10%，年龄越大发病率越高。在慢性肾脏病的形成过程中，细胞凋亡在其中的作用越来越受到大家的瞩目[1-2]。细胞凋亡又称程序性的细胞死亡，一直是国内外学者研究的热点。研究表明，凋亡可以导致肾脏细胞减少，导致肾脏功能障碍。在某些肾脏疾病模型中，如IgA肾病、红斑狼疮性肾炎等，肾小球硬化、肾脏功能的损害与肾小球细胞的凋亡密切相关。另外，肾小管及肾间质细胞的凋亡也可导致肾囊肿和肾纤维化的发生[3]。有研究表明，在5/6肾切除大鼠模型中，肾小球的硬化和肾小管萎缩、消失与肾小球内皮细胞的凋亡密不可分[4]。近年来发现，Bcl-2 家族是在细胞凋亡中有重要作用的一类蛋白质，在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要作用，而Bcl-2 和Bax 分别是此家族中最有代表性的抑制凋亡和促进凋亡基因[5]。本课题在损害肾淋巴循环基础上研究凋亡是否参与了其中的发病过程，Bax/Bcl-2在此过程中的表达又如何？从而为临床上慢性肾脏病的发生寻找新的证据。1 材料与方法1.1 实验动物分组与模型制作雄性Wistar大鼠48只，体重180～200 g（山东大学实验动物中心提供）。所有大鼠按照随机原则分为两组：对照组和模型组各24只。对照组大鼠经3%水合氯醛（1 ml/100 g）腹腔麻醉，分离出肾脏后切除右肾，模型组大鼠在此基础上再结扎左肾淋巴管，方法参考Wilcox等[6-7]，即在肾被膜下及肾实质内注射0.5 ml 2% Evans蓝，显示清楚淋巴管后在外科手术显微镜下用4号线结扎左肾肾门淋巴管，并结扎左肾上下极脂肪纤维组织以阻断被膜下淋巴循环。各组大鼠分别于术后第1、7、14、28天各处死6只。1.2 标本留取 所有大鼠于处死前1 d开始留取24 h尿液，以测尿蛋白。处死过程中心脏取血测血肌酐。肾脏组织经过充分灌洗后，分为两部分，一部分用于免疫组织化学；另一部分用于Western blot和Real-time PCR。1.3 免疫组织化学检测肾脏组织经常规脱蜡、水化，然后切片，用3% H2O2封闭，再经微波修复后滴加Ⅰ抗（Bax工作浓度为1∶50，Bcl-2工作浓度为1∶1000。 Biosciences Pharmingen USA），放于4 ℃冷藏过夜。加入Ⅱ抗山羊抗兔IgG抗体（购自武汉博士德生物公司）。经DAB显色、苏木素复染后，再按常规方法脱水、封片等，最后置于显微镜下观察结果。所有实验均设阴性对照，以PBS代替Ⅰ抗。本实验中所用免疫组织化学试剂盒等购自北京中杉生物公司。1.4 Western blot检测过程根据组织总蛋白提取试剂盒（购自申能博彩公司）说明方法提取大鼠肾脏总蛋白，然后用BCA法测定组织蛋白浓度。经过灌胶、电泳、转膜、牛奶封闭等过程后，加Ⅰ抗（Ⅰ抗浓度Bax 1∶1000，Bcl-2 1∶1000，β-actin单抗1∶5000）4 ℃冷藏过夜。加Ⅱ抗（1∶2500），室温放置1 h。然后根据ECL试剂盒（购自 Santa Cruz公司）说明在胶片上曝光及定影等，最后测定各蛋白带的灰度值，所有目的蛋白带的灰度值与与β-actin的灰度值进行比较，其比值就是各目的蛋白表达的丰度。1.5 Real-time PCR的检测过程取肾组织50 mg左右，按Trizol试剂盒（Invitrogen公司）说明抽提mRNA。并反转录成cDNA（试剂盒TaKaRa公司）。采用ABI PRISM 7000 HT进行Real-time PCR。引物序列（TaKaRa公司设计，上海生物化工有限公司合成）见表1。荧光Real-time PCR采取两步法PCR程序：首先95℃预变性10 s，然后进行PCR反应，95℃ 5 s、60℃ 31 s，经过40个循环。两组间的比较应用Folds=2-ΔΔCt公式[8]进行分析。表1 引物序列1.6 统计学处理 数据采用SPSS 11.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用方差检验与单因素分析，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果2.1 两组大鼠术后第1、7、14、28 天尿蛋白、血肌酐水平的比较 模型组大鼠的尿蛋白于术后第7天即出现明显变化（P<0.05），手术时间越长，肾功能损害越明显。模型组术后第14、28天的尿蛋白水平与同组第7天比较，差异有统计学意义（P<0.05），与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。同样，血肌酐水平变化类似于尿蛋白，模型组大鼠的血肌酐水平在术后第7天开始出现明显变化，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），手术时间越长，肾功能损害越明显。模型组第14天的血肌酐水平与同组第7天比较，差异有统计学意义（P<0.05），与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）（表2）。表2 两组大鼠术后第1、7、14、28 天尿蛋白、血肌酐水平的比较（x±s） 与同组第7天比较，*P<0.05；与对照组同时间比较，#P <0.05，▲P<0.01 2.2 两组大鼠肾组织Bax、Bcl-2的表达（免疫组织化学）对照组大鼠肾组织Bax的表达非常微弱，而模型组大鼠肾组织的Bax表达非常显著，主要的表达部位在肾小管及肾间质，远端小管的表达尤其强烈。Bcl-2表达正好相反，对照组大鼠有明显的Bcl-2表达，其主要部位也在肾小管和肾间质，模型组大鼠Bcl-2的表达却非常微弱（图1）。图1 两组大鼠肾组织Bax、Bcl-2蛋白的表达（免疫组织化学×200）2.3 两组大鼠肾组织Bax、Bcl-2蛋白表达的比较（Western blot）Western blot分析更能说明Bax、Bcl-2蛋白在两组大鼠间的不同表达。阻断肾淋巴循环后，模型组大鼠Bax蛋白的表达量明显增加，这与免疫组织化学观察到的现象基本吻合。在术后第14天，模型组大鼠Bax的蛋白量就达到顶峰（P<0.01），以后维持逐渐增高现象，而凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达从术后第1天就出现下降趋势，Bax/Bcl-2比值明显增高。对照组 Bax的表达非常微弱，相反Bcl-2的表达明显，与模型组正好相反。在整个术后过程中，对照组Bax、Bcl-2的表达基本无明显变化（图2）。2.4 两组大鼠肾组织Bax、Bcl-2 mRNA表达的比较（Real-time PCR）Real-time PCR 从基因水平反映了两组大鼠Bax、Bcl-2的表达情况。实验显示，模型组大鼠Bax的 mRNA表达在所有时间段均呈显著增高趋势，其中高峰期在第7天，而Bcl-2 mRNA表达却呈明显下降（P<0.05），随着术后时间的延长而呈稳步下降的趋势。模型组Bax/Bcl-2 mRNA比值于术后第14天达到高峰（P<0.01），与对照组比较明显增高。相反，对照组不管是Bax还是Bcl-2 ，此两者的表达基本无明显变化（图3）。3 讨论无论健康或疾病状态下，淋巴循环都有其重要的作用，遗憾的是，它的功能至今仍未清楚阐明，甚至被忽略。淋巴循环将间质多余水分带回血液，把抗原和免疫活性细胞带到炎症部位的淋巴结。传统观点认为淋巴系统只是被动的执行这些功能，如今随着淋巴分子机制进一步研究发展，这种观点正受到挑战。近年来，器官功能障碍与其淋巴循环的关系逐渐成为研究热点，但尚未达成共识。有报道称，淋巴循环障碍对组织影响甚微[9]，但也有研究表明，阻断肾脏的淋巴循环可以导致肾脏硬化[10]。本实验就针对肾脏淋巴循环和肾脏功能的关系进行了再次探索与研究。结果表明，当阻断大鼠的肾脏淋巴循环后，大鼠的肾脏功能随之出现变化。模型组大鼠的尿蛋白及血肌酐水平随着术后时间的延长而不断升高。本实验中免疫组织化学结果提示，阻断肾脏的淋巴循环，其影响最明显的是肾小管及肾间质，由此可见，淋巴循环障碍对肾功能的影响是明显的，这就为临床上原因不明的慢性肾脏病，尤其慢性肾小管及肾间质病变提供了新的诊断思路。本研究结果提示，淋巴循环障碍不但损害肾脏功能，并且在此基础上，有关于凋亡的相关基因Bax/Bcl-2的表达也出现明显变化，这为探讨肾脏损伤机制提供了新的线索。众所周知，Bax/Bcl-2在凋亡中的重要作用，其与凋亡的关系一直是近年来研究的热点[11-12]。Bcl-2 家族中Bax是促进凋亡的重要蛋白，与此相反，Bcl-2却是抑制细胞凋亡的蛋白，两者的作用正好相反，因此两者的比值变化往往决定凋亡的发生与否[13-15]。近年来的研究表明，肾细胞的凋亡与Bax/Bcl-2的比值密切相关。提高凋亡促进因子Bax与凋亡抑制因子Bcl-2 的比值，对肾小管萎缩、肾纤维化样的凋亡进程有明显的促进作用[16]。本实验的研究结果证实了这一点。Western blot从蛋白水平反映了模型组大鼠的Bax表达明显增加，尤其在术后14 d就达到高峰。Real-time PCR从基因水平反映了模型组大鼠的Bax表达加强，并且在所有时间段均呈显著增高趋势，而与此形成明显对比的是，Bcl-2表达均成下降趋势。模型组大鼠的Bax/Bcl-2比值明显增高。阻断肾脏的淋巴循环可以引起肾功能减退，此结果与凋亡基因表达的失衡密切相关。由此可以推断，肾脏细胞的凋亡是淋巴循环障碍导致肾功能衰退的重要原因之一。淋巴循环障碍对于肾脏的损害可能不仅限于此，本研究仅揭示了Bax/Bcl-2途径的变化，那么在肾淋巴循环障碍过程中，是否还存在其他病理机制，尚待进一步研究、探索。[参考文献][1] Kitamura H，Shimizu A，Masuda Y，et al.Apoptosis in glomerular endothelial cells during the development of glomerulosclerosis in the remnant kidney model[J].Exp Nephrol，1998，6（4）：328-336.[2] Zhang N，Cheng GY，Liu XZ，et al.Expression of Bcl-2 and NF-κB in brain tissue after acute renal ischemia-reperfusion in rats[J].Asian Pac J Trop Med，2014，7（5）：386-389. [3] 段惠军，史永宏，张艳玲，等.肾切除大鼠残肾细胞凋亡及凋亡相关基因的表达[J].中华物理医学与康复杂志，2001，23（5）：309-311.[4] Nankivell BJ，Borrows RJ，Fung CL，et al.The natural history of chronic allograft nephropathy[J].N Engl J Med，2003， 349（24）：2326-2333.[5] Sabirzhanov B，Zhao Z，Stoica BA，et al.Downregulation of miR-23a and miR-27a following experimental traumatic brain injury induces neuronal cell death through activation of proapoptotic Bcl-2 proteins[J].J Neurosci，2014，34（30）：10055-10071. [6] Wilcox CS，Sterzel RB，Dunckel PT，et al.Renal interstitial pressure and sodium excretion during hilar lymphatic ligation[J].Am J Physiol，1984，247（2 Pt 2）：F344-F351.[7] Stolarczyk J，Carone FA.Effects of renal lymphatic occlusion and venous constriction on renal function[J].Am J Pathol，1975，78（2）： 285-296. [8] Kitamura H，Shimizu A，Masuda Y，et al.Apoptosis in glomerular endothelial cells during the development of glomerulosclerosis in the remnant kidney model[J].Exp Nephrol，1998，6（4）：328-336.[9] 孙旭海，郭延章，王秀中，等.破坏肾淋巴循环对犬自体移植肾组织学的影响[J].第四军医大学学报，2003，24（10）：958-959.[10] Mironov AA，Eremin GA，Vasilenko VA，et al.Changes in kidney tissue elements after ligation of the lymphatic vessels.Role of disorders of lymph outflow after kidney transplantation[J].Arkh Anat Gistol Embriol，1980，79（10）：80-89.[11] Zagorodna O，Martin SM，Rutkowski DT，et al.2-deoxyglucose-induced toxicity is regulated by Bcl-2 family members and is enhanced by antagonizing Bcl-2 in lymphoma cell lines[J].Oncogene，2012，31（22）：2738-2749.[12] Sun Y，Lin Y，Li H，et al.2，5-Hexanedione induces human ovarian granulosa cell apoptosis through BCL-2，BAX，and CASPASE-3 signaling pathways[J].Arch Toxicol，2012，86（2）：205-215.[13] Lalier L，Cartron PF，Juin P，et al.Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis[J].Apoptosis，2007， 12（5）：887-896.[14] Gill MB，Perez-Polo JR.Bax shuttling after rotenone treatment of neuronal primary cultures：effects on cell death phenotypes[J].J Neurosci Res，2009，87（9）：2047-2065. [15] Lee do Y，Lee KS，Lee HJ，et al.Kynurenic acid attenuates MPP（+）-induced dopaminergic neuronal cell death via a Bax-mediated mitochondrial pathway[J].Eur J Cell Biol，2008，87（6）：389-397.[16] Rossé T，Olivier R， Monney L，et al.Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome c[J].Nature，1998，391（6666）： 496-499.（收稿日期：2014-08-26 本文编辑：许俊琴）