深海鱼油对大鼠脂肪肝及胸主动脉的影响研究1）

李亚洁，谢文鸿，吴丽萍，李 梅

脂肪肝是一种多病因引起的、病变主体在肝小叶、以肝细胞内中性脂肪异常沉积为主的临床综合征［1］。高脂血症是形成脂肪肝的基础，高脂血症性脂肪肝如果没有得到及时的治疗很可能逐渐发展为脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝衰竭以及肝癌［2］。动脉粥样硬化（AS）是危害人类健康的常见病，动脉粥样硬化引起的心、脑血管疾病如心肌梗死、脑卒中等是导致人类死亡的主要病因。大量实验与临床资料证明高脂血症是动脉粥样硬化形成的主要危险因素［3］。为有效防治高脂血症、脂肪肝及动脉粥样硬化，国内外都在积极探索和筛选具有调节血脂作用的生物资源［4］。深海鱼油含有丰富的多元不饱和脂肪酸－DHA（二十二碳六烯酸）和EPA（二十碳五烯酸），而多元不饱和脂肪酸DHA和EPA与脂类的吸收及代谢有着密切 的 联 系［5，6］，具 有 调 节 血 脂 的 作用［7，8］。本研究以高脂血症性脂肪肝及动脉粥样硬化早期病理学变化的大鼠为动物模型开展实验研究，观察深海鱼油对其肝组织及胸主动脉的影响。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 深海鱼油 系浙江兴业集团有限公司产品，深海鱼油胶囊每粒 1000 mg，含EPA 330mg、DHA 220mg。人体推荐量为33．33mg／（kg·d）～66．67 mg／（kg·d）。

1．1．2 实验动物 Wistar雄性大鼠，清洁级，36只，体重210g～260g，实验动物质量合格证明号：0102299，许可证号：SCXK（粤）2011－0015；动物由南方医科大学动物实验中心提供。

1．1．3 高脂饲料配方和试剂 高脂饲料由胆固醇0．15%、猪油21%、普通饲料78．85%组成。普通饲料由广东省医学实验动物中心制作，许可证号：SCXK（粤）2008－0002。胆固醇由广州威佳科技有限公司提供，批号：20111215；猪油由中山市明发油脂有限公司提供，批号：20120309。

1．2 方法

1．2．1 动物模型的建立 由于深海鱼油的人体推荐量为33．33mg／（kg·d）～66．67mg／（kg·d），根据人及不同种类动物之间药物剂量的换算，动物与人体的每千克体重剂量折算系数表［9，10］，计算灌胃深海鱼油的剂量为0．21g／kg～0．42g／kg。采用随机数字表法将高脂血症大鼠 36只随机分为空白对照组（n＝8）、模型对照组（n＝8）、深海鱼油组［低剂量组0．21g／kg（n＝10），高剂量组0．42g／kg（n＝10）］。实验期内两个剂量组给予高脂饲料和不同剂量的深海鱼油，模型对照组给予高脂饲料和蒸馏水，空白对照组给予基础饲料和蒸馏水。每天饲喂大鼠时，以模型对照组大鼠食量为标准，各组给予同等重量的饲料。灌胃深海鱼油90d后，取肝脏横断面及胸主动脉纵切面，冰冻切片，并进行油红O染色，观察大鼠肝组织及胸主动脉病理变化（100倍、400倍）。

1．2．2 肝脏病理学观察及评分标准［11，12］取肝脏横断面，冰冻切片，并进行油红O染色，观察肝细胞脂质沉积情况。肝脏脂肪变性程度判定：随机选择10个低倍镜视野（100倍），评估肝细胞浆脂肪大泡、小泡样着色程度，0分为无着色，1分为轻度（＜10% ），2分为中度（10%～25%），3分为重度（26%～50%），4分为极重度（＞50%）。

1．2．3 胸主动脉病理学观察 取胸主动脉纵切面，冰冻切片，并进行油红O染色，光镜下观察胸主动脉血管结构及细胞形态，油红O染色粥样硬化区域脂肪呈鲜红色，细胞核呈蓝色，间质无色。

1．2．4 统计学分析 图像分析仪观察病理切片标本病变程度，结果以均数±标准差（±s）来描述。

2 结果

2．1 大鼠肝脏组织的病理学变化 肝组织冰冻切片油红O染色后的结果判断：脂肪呈红色，细胞核呈淡蓝色。可观察到模型对照组肝细胞油红O染色呈阳性，肝细胞特别是肝血窦周围细胞胞质内出现大量的红染脂质颗粒，证明肝脏存在脂质沉积；空白对照组肝血窦周围细胞胞质内出现微小红染脂质颗粒，说明空白对照组未出现明显变化。模型对照组肝细胞浆脂肪大泡、小泡样着 色程度为（19．10±3．14）%，评分2．00分±0．00分；空白对照组着色程度为（0．60±0．27）%，评分0．40分±0．16分；模型对照组肝组织着色程度、评分显著高于空白对照组（P＜0．01），说明模型对照组肝组织出现中度脂肪变性。深海鱼油低剂量组着色程度为（12．60±2．99）%，评分为1．80分±0．42分，与模型对照组相比差异无统计学意义（P＞0．05）。深海鱼油高剂量组着色程度为（9．90±1．29）%，评分为1．40分±0．52分，明显低于模型对照组（P＜0．01）。见图1。

图1 显微镜下肝脏组织的病理学变化（400倍）

2．2 大鼠胸主动脉的病理学变化 空白对照组大鼠血管壁三层结构明显，内膜光滑，内皮下无脂质沉积；中膜可见明显数层弹力膜，外膜存在；内膜、中膜和外膜分界清楚，管腔面由单层内皮细胞覆盖，细胞完整。低剂量组、高剂量组、模型对照组大鼠血管壁三层结构可见，内膜多见增厚，可见泡沫细胞，中膜弹力膜清晰，平滑肌排列紊乱，可见大小不等、形态不规则泡沫细胞，胞质显多个空泡，内皮下无脂质沉积。见图2。

3 讨论

脂肪性肝病是由遗传－环境－代谢应激相关因素所致的以肝细胞脂肪变性为主的临床病理综合征［13］。高脂血症也是动脉粥样硬化进程中的重要独立危险因素，研究发现，因高脂肪饮食摄入引起的高血脂状态通过诱导局部炎症反应、氧化应激损伤、损害血管内皮细胞代谢等诸多作用，增进动脉粥样硬化的发生发展［14，15］。高脂血症引起脂肪肝及动脉粥样硬化与长期过食脂肪、高胆固醇、低蛋白饮食、体重增加过快、内分泌失调及代谢疾病相关［16］。随着生活水平的提高，高血脂、高胆固醇、脂肪肝、动脉粥样硬化人群越来越多，目前降血脂、预防脂肪肝及动脉粥样硬化的药物大多成本较高、价格昂贵，且副反应大，寻找安全有效的保健食品显得尤为重要［17］，并且防治高脂血症具有很大的医学和社会意义，国内外都在积极探索和筛选具有调节血脂作用的生物资源。

自上世纪，有学者发现格陵兰岛爱斯基摩人和日本人因膳食中富含ω－3多不饱和脂肪酸的海产品，其心肌梗死、慢性炎症、自身免疫病的发病率都很低以来，关于鱼油的研究迅速发展［18］。深海鱼油是一类具有很高应用价值的天然保健品，多元不饱和脂肪酸EPA和DHA是其成分中的特征性脂肪酸。EPA和DHA属于ω－3型多元不饱和脂肪酸，是人体不能合成、需由食物提供的必需脂肪酸［19］。

本实验结果表明，饲喂高脂饲料90 d，模型对照组大鼠肝脏组织存在脂质沉积，出现中度弥漫性肝细胞脂肪变性。低剂量组（0．21g／kg）大鼠出现中度弥漫性肝细胞脂肪变性，推测灌胃深海鱼油量不足未能减轻肝脏内脂肪的沉积。高剂量组（0．42g／kg）大鼠出现轻度肝细胞脂肪变性，说明0．42g／kg剂量的深海鱼油能使肝组织的脂肪变性程度减轻，而脂肪肝的发生、发展与体内血脂水平、脂质过氧化程度有关［20］，可能是由于深海鱼油的生物活性有调节血脂、抗炎［21］、抗氧化［22］等作用有关，至于其确切机制尚需进一步证实。模型对照组大鼠胸主动脉血管壁结构显示，内膜多见增厚，中膜弹力膜清晰，平滑肌排列紊乱，内皮细胞肿胀，内皮细胞损伤、炎性细胞浸润、平滑肌细胞排列紊乱，可见大小不等、形态不规则泡沫细胞，局部增殖，符合动脉粥样硬化早期病理学变化［23］。低剂量组（0．21g／kg）、高剂量组（0．42g／kg）大鼠胸主动脉也出现了动脉粥样硬化早期病变，本实验研究尚未发现深海鱼油具有减轻胸主动脉病变的作用。而深海鱼油具有显著降低总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL－C）的作用［24］，血清中总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇异常升高是导致动脉粥样硬化的重要因素［25］。推测本实验灌胃深海鱼油时间可能较短，对深海鱼油是否具有预防动脉粥样硬化的作用，尚需进一步证实。近年来，随着人们生活方式及膳食结构的改变，由肥胖等因素所致的高脂血症性脂肪肝的发病率日益增加，并有可能发展成脂肪性肝炎、脂肪性肝硬化。据统计，脂肪肝的发病率占平均人口的10%，肥胖者的50%，并且肥胖者脂肪肝和高脂血症常合并存在［26］。脂质代谢紊乱是导致高脂血症的直接原因，高脂血症是动脉粥样硬化的主要原因［27］，高脂血症和动脉粥样硬化是诱发各种心脑血管疾病的危险因素，严重威胁着人们的健康和生活质量。对于脂肪肝病人或心血管疾病高危人群，护理人员对其进行健康教育时，关于保健食品方面根据本实验研究结果可提供理论依据，为有效防治脂肪肝形成或延缓心血管疾病发生具有一定的医学和社会意义。

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