局部针刺对莫诺苯宗诱导C57BL/6小鼠白癜风样模型的影响

祝逸平 王遂泉 李阳 周妙妮 许爱娥

局部针刺对莫诺苯宗诱导C57BL/6小鼠白癜风样模型的影响

祝逸平 王遂泉 李阳 周妙妮 许爱娥

目的探讨外伤对莫诺苯宗诱导白癜风小鼠脱色的影响。方法将40只C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组、针刺组和针刺配合莫诺苯宗组4个组,每组10只。模型组应用40%莫诺苯宗乳膏诱导C57BL/6小鼠脱色,建立白癜风动物模型;针刺配合莫诺苯宗组通过针刺配合40%莫诺苯宗乳膏的方法,研究针刺对小鼠脱色的影响。实验过程中肉眼观察毛发颜色以及共聚焦激光扫描显微镜(RCM)观察皮肤脱色。实验结束后麻醉小鼠,取非用药部位脱色皮肤行组织学检查,HE染色检测淋巴细胞浸润情况,免疫荧光染色检测CD8+T细胞表达。结果模型组小鼠在用药部位及非用药部位均有不同程度脱色。针刺配合莫诺苯宗组小鼠同样具有以上特点,且其脱色出现时间早,面积大并稳定。实验第65天,模型组和针刺配合莫诺苯宗组用药部位的脱色面积指数分别为3.45±0.17和3.90±0.25,两组比较差异有统计学意义,t=7.433,P＜0.05;非用药部位分别为1.90±0.12和2.85±0.27,两组比较差异有统计学意义,t=7.529,P＜0.05。免疫荧光显示非用药部位脱色区CD8+T细胞荧光强度模型组为175.528±10.711,针刺配合莫诺苯宗组为645.928±12.652,两者比较差异有统计学意义,t=8.105,P＜0.05。针刺配合莫诺苯宗组在非用药部位脱色斑局部淋巴细胞和CD8+T细胞浸润更明显。结论局部皮肤屏障破坏可以促进莫诺苯宗诱导的白癜风小鼠脱色。

莫诺苯宗;针刺;白癜风;模型,动物

白癜风是一种皮肤黏膜色素脱失性疾病,其病因及发病机制尚未明确。至今无法提供一个可靠的模型,充分研究该疾病的机制和治疗。莫诺苯宗是一种皮肤脱色剂,早在1939年Oliver等发现在皮革厂工人橡胶手套中莫诺苯宗能引起皮肤色素脱失,这种色素脱失与职业暴露性的白癜风无明显差异［1］。本课题组已利用莫诺苯宗成功建立白癜风动物模型［2］,研究外伤对莫诺苯宗诱导小鼠脱色的作用,进一步验证该模型与人白癜风的相似性。

材料与方法

一、材料

1.动物来源:C57BL/6小鼠,雌性,体质量(15±2)g,购于上海斯莱克实验动物有限公司［生产许可证号SCXK(沪)2012-0002］,在常规实验室条件下饲养。

2.主要仪器和试剂:莫诺苯宗购自美国Sigma公司,由杭州市第三人民医院制剂室制备成不同浓度乳膏。皮肤共聚焦激光扫描显微镜(RCM),美国微维Vivascope 1500型,波长830 nm,最大输出16.0 mW;免疫荧光共聚焦激光扫描显微镜(CLSM),Fluo View FV1000型购自日本Olympus公司。

二、方法

1.分组:C57BL/6小鼠40只,随机分为阴性对照组、模型组、针刺组、针刺配合莫诺苯宗组4个组,每组10只,在小鼠背部2 cm×2 cm范围内脱毛,涂药。阴性对照组涂抹凡士林乳膏50 mg每日1次;模型组涂抹40%莫诺苯宗乳膏50 mg每日1次;针刺组在小鼠背部2.5 cm×2.5 cm范围内均匀针刺15下每3天1次;针刺配合莫诺苯宗组在小鼠背部2.5 cm×2.5 cm范围内均匀针刺15下每3天1次,并在2 cm×2 cm脱毛部位涂抹40%莫诺苯宗乳膏50 mg每日1次。各组小鼠用药50 d,停药后连续15 d肉眼观察小鼠毛发颜色和脱色面积变化,通过RCM观察皮肤脱色。

2.毛发脱色评估:每日肉眼观察毛发脱色,并进行积分记录［3］。将脱色部位分为用药部位和非用药部位,每个部位总分为5分,每只小鼠共10分。小鼠毛发脱色评分标准:0分为毛发无脱色,1分为毛发脱色面积0～10%,2分为毛发脱色面积11%～25%,3分为毛发脱色面积26%～50%,4分为毛发脱色面积51%～75%,5分为毛发脱色面积76% ～100%。

3.皮肤脱色观察:应用激光共聚焦显微镜实时观察建模前后小鼠正常区和脱色区皮肤处在同一层面进行观察皮肤内黑素细胞,并拍照。

4.组织病理:取小鼠非用药部位脱色区域的躯干部皮肤进行HE染色和CD8+T细胞免疫荧光染色,并用CLSM检测CD8+T细胞的荧光定量表达,用单一绿色荧光通道观察,在488 nm波长以上扫描观察,并由计算机自带扫描分析软件测定,每张切片选取荧光表达最强的5个视野(×200),计算单位面积CD8+T细胞的荧光强度。

结 果

一、建立白癜风模型

(一)脱色过程:

1.模型组小鼠:①用药部位:第17天,用药部位出现少量斑点状脱色斑,第21天全部小鼠用药部位均出现斑点状脱色斑,第25～30天形成斑片状脱色斑(图1a,红色圆圈),连续用药至第50天,皮损逐渐扩大并有部分融合;②非用药部位:躯干部位在第27天出现粟粒状脱色斑,第50天有5只小鼠出现脱色斑,皮损扩大成黄豆大(图1a);尾部第37天出现粟粒大小脱色斑,第50天有5只小鼠出现脱色现象(图1b),且有2只小鼠耳部出现针尖样脱色斑。停药后继续观察15 d,发现除1只小鼠出现少量复色,3只小鼠躯干的非用药部位脱色面积有扩大迹象外,其余小鼠脱色稳定。该组小鼠脱色均从用药部位出现脱色,再在非用药部位出现脱色。

2.阴性对照组小鼠:以凡士林外用50 d,未出现脱色斑(图1c)。

(二)RCM观察皮肤脱色:正常小鼠皮肤可见色素正常,色素分布均匀,折光性强(图2a);模型组小鼠非用药区脱色部位皮肤可见色素缺失,折光弱(图2b)。

(三)组织病理:HE染色显示,模型组在真皮浅层有淋巴细胞浸润,阴性对照组仅有少量淋巴细胞浸润。

免疫荧光显示:模型组在真皮浅层有CD8+T细胞浸润(图3a),阴性对照组极少量浸润(图3b)。

二、针刺对莫诺苯宗诱导小鼠脱色的影响

(一)脱色的发生率和时间:针刺配合莫诺苯宗组和模型组小鼠用药部位均出现脱色,非用药部位脱色的发生率分别为90%和50%。而单纯针刺组中有1只小鼠出现1簇针尖状脱色,停止针刺后7 d脱色斑开始复色。

针刺配合莫诺苯宗组小鼠用药部位平均在第13天出现脱色,而模型组为第19天,脱色出现时间延迟6 d。同样,针刺配合莫诺苯宗组小鼠非用药部位出现脱色时间也明显较模型组早,如躯干的非用药部位出现脱色斑的平均时间为第18天,距离用药部位较远的尾部和耳部平均在第29天和32天出现脱色。模型组小鼠躯干的非用药部位,尾部和耳部脱色斑平均在28 d,38 d和40 d出现。

图1 各组小鼠脱色情况 1a:模型组小鼠用药部位脱色斑(红圈),躯干的非用药部位脱色斑(箭头);1b:模型组小鼠尾部脱色斑(箭头);1c:阴性对照小鼠未见脱色斑 图2 共聚焦激光扫描显微镜观察小鼠活体下黑素及黑素细胞 2a:阴性对照小鼠正常皮肤色素正常,分布均匀,折光强(箭头);2b:模型组小鼠非用药部位的脱色斑可见色素缺失,折光弱(箭头) 图3 CD8+T细胞浸润的情况 3a:模型组小鼠在真皮浅层CD8+T细胞浸润;3b:阴性对照组小鼠在真皮浅层极少量CD8+T细胞浸润

(二)脱色面积和稳定性:针刺配合莫诺苯宗组小鼠脱色面积指数用药部位为3.90±0.25,非用药部位为2.85±0.27;模型组小鼠脱色面积指数用药部位为3.45±0.17,非用药部位为1.90±0.12。针刺配合莫诺苯宗组小鼠用药部位和非用药部位脱色面积指数均较模型组大(t用药部位=7.433,t非用药部位=7.529,均P＜0.05),尤其在非用药部位脱色面积差异明显。且停药和针刺后15 d内脱色区稳定没有出现复色,有8只小鼠脱色面积有扩大现象;而模型组中有1只小鼠出现少量复色,3只脱色面积有少量扩大。

(三)CD8+T细胞表达差异:对非用药部位脱色区CD8+T细胞进行免疫荧光染色,通过激光共聚焦扫描显微镜进行观察,对单位面积上荧光强度定量发现对照组免疫荧光切片在绿色背景下极少量CD8+T细胞表达,其荧光强度(61.170±2.051)为荧光背景所致。模型组明显表达CD8+T细胞,其荧光强度(175.528±10.711),针刺配合莫诺苯宗组在绿色背景中可见明显增多的高亮CD8+T细胞,其荧光强度为(645.928±12.652),两者比较t=8.105,P＜O.05,差异有统计学意义。

讨 论

莫诺苯宗能引起皮肤色素脱失,早年认为其主要作用于皮肤深层,可以引起健康个体产生白癜风［1，4-5］。随着近年来对莫诺苯宗研究的深入,明确莫诺苯宗对酪氨酸酶的遍在蛋白化(ubiquitination),可以直接诱导CD8+T细胞反应,杀灭黑素细胞,从而引起皮肤脱色［6］。研究报道［7］利用莫诺苯宗、咪喹莫特乳膏及注射胞嘧啶鸟嘌呤寡聚脱氧核苷酸(cytosine-guanine oligodeoxynucleotides)联合治疗C57BL/6B16黑素瘤小鼠后在距离莫诺苯宗外用部位较远区域出现色素脱失。至今对莫诺苯宗的研究仅限其对黑素瘤的治疗及对黑素细胞等细胞学方面的研究,本实验利用莫诺苯宗建立白癜风动物模型,并研究外伤对莫诺苯宗诱导小鼠脱色的作用。

该模型小鼠脱色过程具有显著特点:外用莫诺苯宗乳膏后首先在用药部位出现斑点状脱色,再在非用药部位出现脱色,如耳部和尾部等。可能通过溶解莫诺苯宗暴露细胞和释放相关细胞因子,引起远处出现免疫反应,从而引起非莫诺苯宗暴露的黑素细胞产生破坏,导致非用药部位脱色［8］。这一脱色过程明显区别于其他化学脱色剂诱导的白癜风模型,如过氧化氢和氢醌等脱色剂只限于在用药部位出现白斑［9-10］。此外,模型小鼠非用药部位真皮浅层CD8+T细胞浸润明显,这一特点与人类白癜风皮损处CD8+T细胞浸润明显一致［11-13］,符合人类白癜风的细胞免疫反应过程。莫诺苯宗起初通过黑素小体自噬作用和酪氨酸酶的遍在蛋白化作用,提呈黑素小体相关抗原并在表面产生MHC(主要组织相容性复合物)Ⅰ和Ⅱ分子,直接诱导CD8+T和CD4+T反应,形成黑素细胞特异性抗体,这一现象在白癜风患者体内可观察到［7］。此外,低水平表达的ROS可以加快外源性抗原分泌物的排泄,从而促进树突细胞提呈黑素细胞特异性抗原,形成CD8+T细胞自身抗原;莫诺苯宗接触皮肤后形成的醌半抗原可能激活自身免疫反应,NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)的病毒相关性抗原触发炎症反应,这种自身免疫反应激活树突细胞分泌Toll样受体7和9及角质形成细胞分泌TLR-9［14］。

本研究还观察针刺对莫诺苯宗诱导小鼠脱色的影响,在莫诺苯宗用药和非用药部位进行针刺,破坏皮肤屏障,结果显示该组小鼠较模型组出现脱色斑时间早,面积大,且非用药部位脱色斑的发生率高。在停药和针刺后15 d内,8只小鼠的脱色斑逐渐扩大,没有出现复色;而模型组小鼠3只有脱色斑扩大迹象,并有1只少量复色。以上说明外伤可以促进模型小鼠脱色的发生和发展。由于针刺破坏局部皮肤屏障,针刺作用可释放细胞因子引起氧化应激反应,体内高活性分子如活性氧等产生过多;且活性氧可以促进来自莫诺苯宗暴露的黑素细胞的外源性抗原分泌物排泄,从而促进树突细胞提呈黑素细胞特异性抗原,形成CD8+T细胞持久的自身抗原,诱导CD8+T细胞,破坏黑素细胞,引起皮肤脱色［8］。

综上所述,本研究利用莫诺苯宗建立白癜风动物模型具有合理性,且针刺外伤可以促进该模型小鼠脱色的发生和发展,进一步证明该模型与人类白癜风具有共性,可用于白癜风相关研究。

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2012-12-28)

(本文编辑:尚淑贤)

Effect of local acupuncture on monobenzone-induced vitiligo-like depigmentation in mice

Zhu Yiping，Wang Suiquan，Li Yang，Zhou Miaoni，Xu Aie.Department of Dermatology，Third People‘s Hospital of Hangzhou Affiliated to Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310053，China

Xu Aie，Email：xuaiehz@msn.com

ObjectiveTo evaluate the effectofinjurieson monobenzone-induced vitiligo-like depigmentation in mice.MethodsForty C57BL/6 mice were randomly and equally divided into four groups：negative control group topically treated with vaseline cream，model group induced by topical monobenzone(40%)cream，acupuncture group receiving acupuncture treatment(15 times)once every three days，and acupuncture combined with monobenzone group receiving both monobenzone induction and acupuncture treatment.The treatment lasted 50 days and mice were sacrificed 15 days after the end of treatment.Hair decolorization was observed with naked eyes，and skin decolorization with reflectance confocal microscopy(RCM)on a daily basis.Tissue specimens were obtained from depigmented skin at monobenzone-uninduced sites，and subjected to hematoxylin and eosin(HE)staining for the cvaluation of lymphocytic infiltration as well as immunofluorescence staining for the detection of CD8+T cell expression.Statistical analysis was done byttest.ResultsVarying degrees of depigmentation were observed in both monobenzone-induced and-uninduced sites in both the model group and acupuncture combined with monobenzone group，and the latter group showed earlier，larger and more stable depigmentation than the former group.At 15 days after the end of treatment，the decolorization area index in the model group and acupuncture combined with monobenzone group was 3.45±0.17 and 3.90±0.25 at monobenzone-induced sites respectively(t=7.433，P＜0.05)，1.90±0.12 and 2.85±0.27 at monobenzone-uninduced sites respectively(t=7.529，P＜0.05).Significant differences were observed in the fluorescence intensity of CD8+T cells at monobenzone-uninduced depigmented sites between the model group and acupuncture combined with monobenzone group(175.528±10.711 vs.645.928 ± 12.652，t=8.105，P ＜ 0.05)，and there was a more evident infiltrate with lymphocytes and CD8+T cells in the monobenzone-uninduced depigmented sites in the acupuncture combined with monobenzone group.ConclusionLocal destruction of skin barrier may promote monobenzone-induced vitiligo-like decolorization in mice.

Monobenzone；Acupuncture；Vitiligo；Models，animal

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.008

国家自然科学基金(81071294);浙江省自然科学基金(Z2100973);杭州市重大科技创新项目(20122513A02)

310053杭州,浙江中医药大学附属杭州市第三人民医院皮肤科

许爱娥,Email:xuaiehz@msn.com