天疱疮患者外周血CD4+T细胞活化状态及其表面共刺激分子的表达

刘芝翠 元慧杰 曾维宏 张晨星 王颖 郑捷 潘萌

·论著·

天疱疮患者外周血CD4+T细胞活化状态及其表面共刺激分子的表达

刘芝翠 元慧杰 曾维宏 张晨星 王颖 郑捷 潘萌

目的探讨天疱疮患者和健康人外周血CD4+T细胞的活化状态及其表面共刺激分子的表达情况。方法收集天疱疮患者90例,其中初发24例,稳定期51例,复发期15例;健康对照30例。运用流式细胞仪检测天疱疮患者外周血CD4+T细胞的活化标志CD69及其表面共刺激分子,包括细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、诱导性协同刺激分子(ICOS)、CD40配体(CD40L)和OX40的表达情况,并和健康对照组进行比较。用Graphpad 5.0软件进行统计分析,两组间比较采用非参数(Mann-Whitney test)检验。结果天疱疮患者外周血CD4+T细胞表面CD69表达比例为(2.46±0.19)%,显著高于健康对照组［(1.26±0.19)%,P＜0.01］,且初发、稳定期和复发期天疱疮患者CD4+T细胞表面CD69的表达均显著高于健康对照组(P＜0.01),但不同病期患者间差异无统计学意义。天疱疮患者CD4+T细胞表面ICAM-1、CD40L和OX40的表达比例分别为(55.88±1.67)%、(2.23±0.22)%和(2.55±0.29)%,分别显著高于健康对照组［(47.75±2.52)%、(0.73±0.07)%和(0.62±0.17)%,P＜0.05或0.01］,但在初发、稳定期和复发期患者之间差异无统计学意义;ICOS的表达在初发患者中显著高于健康对照组,分别为(3.73±0.60)%和(2.39±0.16)%(P＜0.05)。结论天疱疮患者外周血CD4+T细胞处于相对活化的状态,其表面的共刺激分子也呈高表达,表明CD4+T细胞可能通过高表达的共刺激分子和B细胞相互作用,参与疾病的发生和发展。

天疱疮;T淋巴细胞,辅助诱导;共刺激分子

天疱疮是一种器官特异性自身免疫性疾病,累及皮肤和黏膜。临床上主要分为寻常型天疱疮和落叶型天疱疮。其经典的发病机制为患者体内产生直接针对角质形成细胞桥粒结构中的桥粒芯糖蛋白3(desmoglein 3，Dsg3)和(或)桥粒芯糖蛋白1(desmoglein 1，Dsg1)的自身抗体［1］,抗体与抗原分子结合,导致细胞间的黏附能力丧失,出现临床和病理表现。目前研究发现,在B细胞活化和分化为抗体产生细胞的过程中,辅助性T细胞(Th细胞)起着重要的辅助作用［2］。除了通过分泌细胞因子对B细胞免疫应答发挥免疫调节作用,活化的Th细胞还通过上调表面多种分子,增强T-B细胞间相互作用,传递B细胞活化和分化所需要的协同刺激信号,促进B细胞进一步分化为浆细胞产生抗体。目前已经发现在B细胞活化过程中,参与T-B细胞间相互作用的分子包括细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和其受体淋巴细胞功能相关抗原(lymphocyte functional antigen-1,LFA-1)、诱导性协同刺激分子(inducible co-stimulatory molecule,ICOS)和其配体(ICOS-L)、CD40-CD40L、OX40-OX40L 等, 这些分子共同形成Th细胞与B细胞之间的免疫突触,介导T-B细胞之间协同刺激信号的传导,进而促进B细胞活化。为了进一步明确CD4+T细胞在疾病中的作用,我们用流式细胞仪对天疱疮患者外周血CD4+T细胞的活化状态及其表面参与T-B细胞间相互作用的共刺激分子的表达进行初步探讨。

对象与方法

一、对象

2012年9月至2013年2月初诊并随访于上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科的天疱疮患者90例,其中寻常型天疱疮患者46例,落叶型天疱疮患者44例。所有患者均根据临床表现、组织病理、免疫病理和自身抗体检测明确诊断。根据病程及治疗情况,将患者分为3组,即初发、稳定期和复发期患者,其中未局部或系统应用激素或其他免疫抑制剂治疗者为初发患者;每天口服泼尼松≤15 mg,皮肤黏膜无新发皮损连续 ≥30 d者为稳定期患者;病情稳定1个月以上,又出现新发皮损或黏膜损害为复发期患者。患者组中初发患者24例,稳定期患者51例,复发期患者15例。健康对照外周血来自健康捐献者,共计30例。本研究通过医院伦理委员会批准,患者签署知情同意书。

二、主要试剂与仪器

R-藻红蛋白(PE)-鼠抗人CD69产自美国eBioscience公司;异硫氰酸荧光素(FITC)-鼠抗人CD4、太平洋蓝(Pacific blue)-鼠抗人 CD4、PECyTM5-鼠抗人 CD54(ICAM-1)、PE-抗人 CD278(ICOS)、别藻蓝蛋白(APC)-鼠抗人CD154(CD40L)和FITC-鼠抗人CD134(OX40)产自美国BD公司;LymphoprepTM淋巴细胞分离液产自挪威Axis-shield公司;FACS CantoⅡ流式细胞仪产自美国BD Bioscience公司。

三、方法

1.外周血单一核细胞(PBMC)分离:健康人和天疱疮患者外周血4 ml,肝素抗凝,用淋巴细胞分离液经密度梯度法分离获得外周血淋巴细胞。

2.流式细胞仪检测PBMC中CD4+T细胞的活化标志及表面共刺激分子的表达:每2×105个细胞重悬于100 μl PBS,根据不同流式抗体组合,按照抗体与PBS的体积比例1∶100分别加入荧光抗体:Pacific Blue-抗人 CD4、FITC-抗人 CD4、PE-抗人 CD69、PECyTM5-抗人 ICAM-1、PE-抗人 ICOS、APC-抗人-CD40L和FITC-抗人OX40,室温下避光孵育30 min,用PBS洗涤1次后,2%多聚甲醛固定,用FACS CantoⅡ流式细胞仪和Flowjo软件检测和分析。

3.统计学方法:用Graphpad 5.0统计软件进行统计分析,所有数据以表示。用非参数检验(Mann-Whitney test)比较两组间的差异,P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、天疱疮患者外周血CD4+T细胞的活化状态

图1 天疱疮患者(1a)与健康对照(1b)外周血CD4+T细胞活化状态比较

图2 天疱疮患者与健康人外周血CD4+T细胞表面细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、协同共刺激分子(ICOS)、CD40的配体(CD40L)和OX40的表达比较

天疱疮患者外周血CD4+T细胞表面CD69的表达比例为(2.46±0.19)%,显著高于健康对照组(1.26±0.19)%,差异有统计学意义(P＜0.01,图1a,1b);初发、稳定期和复发期天疱疮患者CD4+T细胞表面CD69的表达比例分别为(2.77±0.40)%、(2.15±0.25)%和(2.36±0.35)%,与健康对照组相比较均有显著升高(均P＜0.01),而患者组之间差异无统计学意义。

二、天疱疮患者外周血CD4+T细胞表面共刺激分子的表达

与健康对照相比较,天疱疮患者来源的CD4+T细胞表面ICAM-1的表达比例为(55.88±1.67)%,CD40L为(2.23±0.22)%,OX40为(2.55±0.29)%,均显著高于健康对照组［(47.75±2.52)%、(0.73±0.07)%和(0.62±0.17)%,P＜0.05或0.01)］;ICOS的表达虽然有升高,但差异无统计学意义(图2)。

三、天疱疮不同病期患者之间CD4+T细胞表面共刺激分子的表达

CD40L在初发、稳定期和复发期患者的表达水平为(2.16±0.28)%、(2.08±0.26)%和(2.20±0.68)%,均显著高于健康对照组［(0.72±0.07)%,均P＜0.01］,但不同分期患者之间CD40L的表达差异无统计学意义(表1);OX40在初发、稳定期和复发期患者的表达水平为(2.44±0.43)%、(2.46±0.38)%和(1.53±0.34)%,均显著高于健康对照组的(0.62±0.17)%(均P＜0.01),不同分期患者之间OX40的表达差异无统计学意义(表1);ICOS的表达虽然在整体水平未显示出明显差异,但在初发期患者CD4+T细胞表面的表达比例为(3.73±0.60)%,显著高于健康对照组的(2.39±0.16)%(P＜0.05,表1);而ICAM-1的表达虽然整体水平高于健康人,但不同分期患者之间及分别与健康人相比较差异均无统计学意义(图2,表1)。

表1 不同病期天疱疮患者之间CD4+T细胞表面共刺激分子表达比较

表1 不同病期天疱疮患者之间CD4+T细胞表面共刺激分子表达比较

注:与健康人比较,a:P ＜0.05,b:P＜0.01

组别 例数 黏附分子1 诱导性协同刺激分子 CD40L OX40健康对照组 30 48.52±2.56 2.39±0.16 0.72±0.07 0.62±0.17天疱疮组稳定期 51 54.73±2.06 2.53±0.21 2.08±0.26b 2.46±0.38b复发期 15 56.08±3.94 2.99±0.59 2.20±0.68b 1.53±0.34b初发 24 54.97±3.30 3.73±0.60a 2.16±0.28b 2.44±0.43b

讨 论

Nishifuji等［3］通过酶联免疫斑点法(ELISPOT)分析发现,寻常性天疱疮患者外周血T细胞和Dsg3在体外可刺激自身反应性B细胞活化和分泌抗Dsg3自身抗体,而当CD4+T细胞耗竭时,自身反性B细胞活化和Dsg3自身抗体产生缺失。Takahashi等［4］在寻常型天疱疮小鼠模型中,通过将Dsg3特异性CD4+T细胞和从Dsg3免疫的Dsg3-/-小鼠中获得的B细胞一起过继转移到Rag-2-/-小鼠体内,可以诱导受体鼠产生典型的疾病表型,抗Dsg3 IgG抗体的产生和皮肤棘层松解性大疱形成。本课题组证实在天疱疮中Th2-B细胞的相互接触对抗体的产生是必不可少的［5］,而且T-B细胞体外共培养实验证明,ICAM-1和ICOS不同程度地参与活化的CD4+T细胞促进B细胞产生抗体［6］。因此,研究天疱疮患者体内CD4+T细胞活化状态、功能以及表面参与T/B细胞相互作用的共刺激分子表达情况,对进一步解释天疱疮自身抗体的产生具有重要意义。

目前,国内外尚未见通过共刺激分子来明确天疱疮患者T细胞对B细胞产生抗体的辅助作用的研究,但这些分子在其他疾病或疾病模型中有一定的研究。如Su等［7］研究表明,SLE患者与健康人相比较外周血单一核淋巴细胞中CD69/CD3的比值明显升高,与SLE疾病活动性评分(SLEDAI)具有高度相关性。ICAM-1和LFA-1作为介导细胞间相互作用的一对重要的黏附分子,也是与T细胞和B细胞活化密切相关的协同刺激受体和配体,影响T、B淋巴细胞的激活、增殖和分化［8］。在B细胞的活化过程中。Carrasco等［9］利用平面脂双层和ICAM-1融合绿色荧光蛋白的细胞,证明ICAM-1和LFA-1的相互作用通过增强B细胞的黏附和促进免疫突触形成,降低B细胞活化的阈值,促进B细胞的活化。目前研究发现,ICAM-1的表达异常和SLE、多发性硬化、甲状腺炎和胰岛素依赖型糖尿病等的发生有关。CD40L和CD40是B细胞所需要的接触介导信号中的一个非常关键的分子,参与介导T细胞与B细胞之间的共刺激信号的转导。Aoki-Ota等［10］采用寻常型天疱疮小鼠模型,在过继转移前,给予小鼠抗CD40L抗体,基本完全阻断了抗Dsg3的IgG抗体的产生和大疱的形成,诱导Dsg3的免疫耐受可持续70 d,甚至在重新免疫或过继转移免疫后的Dsg-/-脾脏细胞后仍可以维持,提示CD40L-CD40相互作用参与致病性抗Dsg3 IgG抗体的产生。OX40(CD134)主要表达在活化的T细胞上,通过与表达在B细胞上的配体OX40L结合,传递协同刺激信号,促进T细胞依赖的B细胞增殖和分化［11］,增加抗体的产生。研究表明,OX40在多种自身免疫性疾病中发挥作用,如OX40在狼疮肾炎患者CD4+T细胞表面的表达显著升高,并且与疾病的活动性相关［12］。本研究显示,与健康人CD4+T细胞相比较,天疱疮患者外周血来源的CD4+T细胞表面CD69的表达升高,同时其表面的共刺激分子ICAM-1、CD40L和OX40的表达亦显著高于健康对照组,ICOS的表达在初发患者显著高于健康对照组。另外,我们的结果还显示,不同分期患者CD4+T细胞表面CD69、CD40L和OX40均高于健康对照组,而这些分子在初发期、稳定期和复发期患者之间未显示出明显差异。上述结果表明,天疱疮外周血CD4+T细胞通过其表面高表达共刺激分子和B细胞相互作用,进而促进自身抗体的产生,诱发天疱疮的发病和进展,但该作用可能在疾病的不同病期间没有明显差异。

值得一提的是,我们发现ICOS的表达在患者和健康人之间差异无统计学意义,但在初发患者中的表达明显升高。ICOS和ICOSL是T-B细胞之间相互作用的协同刺激分子之一,传递正向信号。研究表明ICOSL缺失的小鼠模型中,由于缺少T细胞对B细胞的辅助,其Th细胞介导的体液免疫应答受损,生发中心形成受损,并且血清中抗体的类型异常,IgG和IgE水平降低［13］。 ICOS主要表达在活化的T细胞上,参与生发中心的形成、抗体的类别转换和记忆性B细胞的形成［14］。我们的结果提示ICOS可能在疾病初期发挥明显辅助B细胞活化的作用,但在激素或免疫抑制剂的作用下,更容易较快出现下调。而其他共刺激分子的相继活化,使效应进一步放大,更好地完成T-B细胞间的相互作用。

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2013-05-09)

(本文编辑:尚淑贤)

Activation state of and expressions of surface co-stimulatory molecules on peripheral CD4+T cells from patients with pemphigus

Liu Zhicui*，Yuan Huijie，Zeng Weihong，Zhang Chenxing，Wang Ying，Zheng Jie，Pan Meng.*Department of Dermatology，Ruijin Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200025，China

Pan Meng，Email：panmeng@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the activation state of and expressions of surface co-stimulatory molecules on peripheral CD4+T cells from patients with pemphigus and healthy human controls.MethodsNinety patients with pemphigus including 24 patients with first-onset pemphigus，51 with quiescent pemphigus and 15 with recurrent pemphigus，as well as 30 healthy human controls were enrolled in this study.Peripheral blood samples were obtained from these subjects followed by lymphocyte isolation.Flow cytometry was performed to detect the expressions of CD69，intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)，inducible co-stimulatory molecule(ICOS)，CD40 ligand(CD40L)and OX40 on CD4+T cells.Statistical analysis was done by Mann-Whitney test using Graphpad 5.0 software.ResultsThe expression rate of CD69 on peripheral CD4+T cells from the healthy human controls was significantly lower than that from patients with pemphigus，patients with first-onset pemphigus，patients with quiescent pemphigus，and patients with recurrent pemphigus((1.26±0.19)%vs.(2.46±0.19)%，(2.77±0.40)%，(2.15±0.25)%and(2.36±0.35)%，allP＜0.05).The patients with pemphigus also showed a significant increase in the expression rates of ICAM-1，CD40L and OX40 compared with the healthy human controls((55.88±1.67)%vs.(47.75±2.52)%，P＜0.05；(2.23±0.22)%vs.(0.73±0.07)%，P＜0.01；(2.55±0.29)%vs.(0.62±0.17)%，P＜0.01).No significant differences were observed between patients with different stages of pemphigus in the expression rates of CD69，ICAM-1，CD40L or OX40(allP ＞ 0.05).The percentage of ICOS-expressing CD4+T cells was significantly up-regulated in only patients with first-onset pemphigus as compared to the healthy controls((3.73±0.60)%vs.(2.39±0.16)%，P＜0.05).ConclusionsThe peripheral blood CD4+T cells from patients with pemphigus are in a relatively active state with up-regulated surface expressions of many costimulatory molecules，suggesting that CD4+T cells are involved in the initiation and progression of pemphigus by interacting with B cells through co-stimulatory molecules.

Pemphigus；T-lymphocytes，helper-inducer；Costimulatory molecule

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.003

国家自然科学基金(81171499);上海市科委科研计划项目(10JC1410600)

200025上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科(刘芝翠、元慧杰、郑捷、潘萌);上海交通大学医学院,上海市免疫学研究所(曾维宏、张晨星、王颖)

潘萌,Email:panmeng@medmail.com.cn