细胞分裂周期蛋白2启动子报告基因载体的构建与鉴定*

周辉吴 炜赵明

细胞分裂周期蛋白2(cell division cycle 2,Cdc2)又叫细胞周期蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependent kinases1,CDK1），是一个高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在整个细胞周期调控中特别是G2至M期起关键作用。G2后期Cdc2激酶与积累的周期蛋白B(cyclin B)结合形成Cdc2-cyclinB复合物，也称有丝分裂促进因子(MPF)，推进细胞周期进入有丝分裂M期[1-2]。Cdc2激酶的过度表达，可使细胞周期进程紊乱，以致细胞不能正常生长、分化，导致细胞恶性增殖，形成肿瘤[3]。本实验通过构建Cdc2基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒，并在骨肉瘤细胞U2OS中验证其启动子转录活性，旨在利用该报告基因来筛选新的抗肿瘤药物，并为研究临床抗肿瘤药物的分子生物学机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 U2OS细胞株购自中科院上海细胞库。大肠杆菌感受态细胞DH5α、载体质粒pGL3-Basic、内参质粒pRL-SV40本科室保留。人血基因组DNA纯化试剂盒购自天根生化科技公司。DNA片段凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；KOD FX DNA聚合酶、Ligase high酶购自TOYOBO；限制性内切酶ScaⅠ和XhoⅠ购自大连TaKaRa公司；质粒提取试剂盒和转染脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；胰蛋白酶、新生牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司；琼脂粉（Agar）、胰蛋白胨（Tryptone）、酵母浸出粉（Yeast Extract）购自英国Oxoid公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Dual-Luciferase Reporter Assay System）购自美国Promega公司。所用仪器：PCR仪（美国Bio-Rad公司）；电泳仪（北京百晶）；凝胶图像分析仪（法国Vilber Lourmat公司）；高速离心机（美国Beckman公司）；多孔板高效阅读器（美国Molecular Devices公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 应用UCSC基因组浏览器查找人Cdc2基因启动子序列。根据参考文献[4]，确定本实验研究Cdc2基因启动子长度为3 273 bp（-3 198 bp～+75 bp）。并用Primer 5分析启动子序列上的限制性内切酶位点。设计其两端引物（PCR引物合成由上海英骏生物技术有限公司完成）。上游引物：5＇-TGATGAGCTCTTTTAGAAGGAGTCTC⁃GCTC-3＇，包含Cdc2基因启动子碱基，1个SacⅠ内切酶识别位点，4个保护碱基。下游引物：5＇-TAATCTCGAGACCGC⁃GTCGCTCTCCGCTCA-3＇，包含Cdc2基因启动子互补碱基，1个XhoⅠ识别位点，4个保护碱基。产物大小3 293 bp。

1.2.2 Cdc2启动子的PCR扩增 取正常人外周血5 mL，按照血液基因组DNA提取试剂盒的操作方法，提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，用KOD FX DNA聚合酶进行PCR扩增反应；反应条件为94℃预变性2 min，98℃变性10 s，65℃退火30 s，68℃延伸3 min 30 s，共进行35个循环。反应结束后，将PCR产物于1%琼脂糖胶电泳，利用凝胶回收试剂盒回收PCR产物。

1.2.3 Cdc2基因启动子报告基因质粒的构建 采用pGL3-Basic载体质粒转化氯化钙感受态细胞DH5α，挑单克隆进行大量扩增；用质粒抽提试剂盒制备扩增pGL3-Basic质粒，用紫外分光光度仪测定纯度和浓度。先后用限制性内切酶SacⅠ和XhoⅠ对回收的Cdc2启动子PCR产物和pGL3-Basic载体质粒进行双酶切，电泳后切胶回收酶切产物。用Ligase high连接酶将酶切回收后的载体片段和目的DNA片段进行连接反应，16℃孵育过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆于含有氨苄青霉素抗性的LB（Luria-Bertani）液体培养基中，37℃，200 r/min，培养8 h后取少量进行菌液PCR，其余的液体继续震荡培养至14 h，对菌液PCR显示阳性的菌液，用质粒小提试剂盒提取质粒后，双酶切初步鉴定重组质粒，挑取阳性样本测序。重组质粒pGL3-Cdc2-pro⁃moter和内参质粒pRL-SV40共转染U2OS细胞后，测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶报告基因活性，并将两者的比值作为衡量Cdc2启动子活性的依据，pRL-SV40作为内参可以消除由于细胞数目及转染效率等不同所带来的组间差异。

1.2.4 质粒共转染骨肉瘤U2OS细胞 将U2OS细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。在转染的前1 d将U2OS细胞以1×104的密度接种于24孔板并换用无抗生素的含10%胎牛血清培养基，在37℃，5%CO2培养箱中培养，直至细胞密度达到80%。按照Lipofectamine 2000试剂盒操作说明，瞬时转染Cdc2基因启动子荧光素酶报告基因质粒pGL3-Cdc2-promoter及内参照质粒pRL-SV40。另设一组转染空质粒pGL3-Basic和内参pRL-SV40质粒作为对照组。

1.2.5 Cdc2启动子活性测定 转染24 h后，每孔细胞用PBS洗涤2次。按照Promega公司的双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Dual-Luciferase Reporter Assay System）说明书，每孔加入100 μL的PLB（Passive Lysis Buffer）裂解细胞，于摇床上震摇15 min，收集细胞裂解液。取20 μL细胞裂解液，先用多孔板高效阅读器读取背景值。每孔加入100 μL的LARⅡ工作液，读取萤火虫荧光素酶发光值。再加入100 μL的Stopamp;GloRReagen（t萤火虫荧光素酶终止液和海肾荧光素酶的底物），读取海肾荧光素酶发光值。2组细胞同时检测，每组细胞重复检测3次。以萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值作为相对荧光素酶活性。

1.3 统计学方法 应用SPSS 13.0软件进行分析，计量资料以x±s表示，采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Cdc2启动子片段的扩增 以正常人血细胞基因组DNA为模板，克隆Cdc2启动子片段，1%琼脂糖胶电泳可在3 000 bp附近可见单一条带，见图1A，与3 273 bp的Cdc2基因启动子大小相符。

2.2 报告基因pGL3-Cdc2-promoter载体构建 胶回收后的Cdc2启动子片段和pGL3-Basic双酶切后，见图1B。连接、转化，构建pGL3-Cdc2-promoter重组质粒。对菌液PCR阳性的样品提质粒后，再用SacⅠ和XhoⅠ进行双酶切。酶切产物电泳可在3 000 bp和5 000 bp附近处出现2个条带，这与插入的3 273 bp的Cdc2启动子目的片段和4 800 bp的线性pGL3-Basic大小完全一致，见图2。测序结果显示，Cdc2基因启动子成功插入到pGL3-Basic载体中，见图3，且未发现碱基突变。

Figure 1 Electrophoresis of Cdc2 promoter PCR product and digestion of pGL3-Basic plasmids by endonucleases图1 Cdc2启动子片段的PCR及pGL3-Basic双酶切电泳图

2.3 重组质粒的功能鉴定 检测到瞬时共转染pGL3-Cdc2-promoter/pRL-SV40组荧光素酶活性为1.591 5±0.199 8，高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40组的荧光素酶活性0.049 9±0.010 4，差异有统计学意义(t=13.346，P＜0.01)。

Figure 2 The digestion verification of recombinant plasmid pGL3-Cdc2-promoter by endonucleases图2 重组质粒pGL3-Cdc2-promoter双酶切鉴定

3 讨论

在哺乳动物细胞中，细胞周期是在一系列细胞周期素依赖性激酶（CDKs）和催化亚基周期素（cy⁃clins）共同调节下忠实而有序地启动和完成的细胞周期事件。细胞周期的基本顺序是G1-S-G2-M。CyclinD-CDK4/6和cyclinE-CDK2作用于G1期并推动G1/S进程。Cdc2与cyclinB家族蛋白结合形成MPF是细胞顺利进行S期及G2/M转变的必要保障[5]。然而近年研究发现，在CDK2敲除的情况下，Cdc2可与cylclinE形成复合物，代替CDK2的功能，促进G1/S的转换[6]。Cdc2对整个细胞分裂进程的调节起着中心作用。

Figure 3 Sequence peaks of Cdc2 promoter and comparison results of BLAST图3 Cdc2启动子的测序峰图及BLAST比对结果

通过凝胶阻滞实验、基因足迹分析Cdc2的启动子，发现 ATF、Sp1、CCAAT 盒、CDE/CHR、est-2、E2F、cMyb和 IG（E-box）等多个转录因子结合位点[7-8]。它们共同调节着Cdc2在不同信号通路下的表达。E2F是最早开始研究，也是研究得最为透彻的Cdc2启动子转录因子结合位点。CyclinD-CDK4/6激酶复合体可磷酸化Rb/E2F复合体中的Rb蛋白，使E2F转录因子得以释放出来与Cdc2启动子结合，从而起始Cdc2的转录表达。CyclinD-CDK4/6复合体受p15、p16、p18、p19、p21等细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白（cyclin-dependent kinese inhibitors,CKI）的负向调节。许多肿瘤细胞，例如U2OS、HeLa等，p16表达缺如，导致Cdc2蛋白过度表达，细胞周期调控失衡，细胞过度增生形成肿瘤[4]。

细胞周期调控异常是肿瘤发生发展的重要生物学基础。CDKs的表达及活性的调控异常是恶性肿瘤的共同特征，这使得CDK蛋白家族成为抗癌药物极具前景的靶点[9]。Cdc2的过表达会引起细胞恶性增殖，而且Cdc2的表达量与肿瘤的发生、浸润、转移及复发等明显相关。已有研究表明，在结肠癌[10]、肝癌[11]、非小细胞肺癌[12]、前列腺癌[13]等肿瘤细胞中都检测到Cdc2过表达。Elangovan等[14]发现三烯生育酚能通过抑制CDK4和cyclinD1的表达，抑制Rb的磷酸化，阻碍下游E2F转录因子与Cdc2启动子的结合，下调Cdc2的转录表达，阻滞乳腺癌细胞的分裂增殖，达到治疗乳腺癌的目的。

荧光素酶报告基因法是目前用于分析转录调控的常用方法。本研究通过将Cdc2基因的启动子序列克隆至含荧光素酶的报告基因而无启动子的表达质粒PGL3-basic中，并与含海肾荧光素酶的内参质粒pRL-SV40共转染到骨肉瘤细胞U2OS细胞中，通过检测荧光素酶的表达量反映启动子序列的活性，间接反映Cdc2基因在细胞中的转录表达水平，并验证了其活性。值得注意的是，XhoⅠ对超螺旋状态的pGL3-Basic质粒酶切不完全，但是对线性质粒的酶切效果良好。所以笔者在做质粒的双酶切时，先用SacⅠ将超螺旋质粒酶切成为线性质粒后再加入XhoⅠ，取得了良好的效果。

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