婴幼儿人巨细胞病毒mRNA在不同感染时期表达的研究

李 娟 刘风林 张书红

我国是人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）感染的高发流行地区[1]。除先天性感染外，经产道传播、母乳传播、家庭内传播亦是婴幼儿感染HCMV的重要途径[2]。HCMV感染临床表现无特异性，且存在潜伏性感染，从轻微无症状感染直到严重缺陷或死亡。因而早期诊断、早期治疗对预后至关重要。但目前DNA-PCR检测HCMV只能证明病毒存在，并不能反映病毒复制。HCMV基因转录产物IE mRNA及pp67 mRNA的检测已应用于器官移植后患者是否存在HCMV活动性感染的早期诊断[3-4]，并已作为HCMV宫内活动性感染的特异性指标[5]，但尚少见针对婴幼儿HCMV感染者的研究。本研究拟通过对HCMV基因转录产物IE mRNA和pp67 mRNA的检测，探讨mRNA表达是否可以作为婴幼儿HCMV感染的诊断方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2009年5月—2011年11月我院消化科收治的以黄疸、肝脾肿大、发热、咳喘、腹泻、抽搐为主要症状的1～6个月患儿。入院后行肝功能，血、尿、痰CMV-DNA，CMV-IgM，CMVpp67检测。选择结果满足血、尿、痰CMVDNA拷贝数增高、血CMV-IgM、CMVpp67检测呈阳性中任意一项同时除外其他病毒感染者入阳性组，共105例。并进一步行头CT、听力及眼底检查，综合临床症状体征及各项检查结果做出判断。而血、尿、痰CMV-DNA拷贝数增高，血CMV-IgM、CMVpp67检测均呈阴性,同时除外其他病毒感染者列入阴性组，共98例。2组间月龄、性别和体质量比较，差异无统计学意义，见表1。

Tab.1 General information of infants who were either positive or negative of CMV infection with current clinic diagnosis standards表1 阳性组与阴性组患儿一般情况比较

1.2 实验材料与试剂 RNA抽提试剂盒及实时荧光定量（real-time）PCR反应试剂盒（QIAGEN，Germany）。Real-time PCR仪及数据分析软件（ABI 7500，Life Technologies，US）。

1.3 方法

1.3.1 生化指标的检测 所有患儿抽取股静脉血1～2 mL，TBIL、DBIL、ALT及ALP指标均采用试剂盒进行检测，而HC⁃MV-DNA则采用裂解液破碎细胞，使得病毒颗粒游离，然后14 000×g离心10 min，取上清，利用荧光定量方法对病毒DNA拷贝数进行定量检测。

1.3.2 cDNA的合成 参照参考文献[4]，采用Trizol方法抽提血清样本总RNA，并用紫外分光光度计检测RNA的浓度与纯度，检测光密度（OD）260/OD280数值在1.8～2.0之间时，证明提取的RNA纯度适合于进行下一步实验。4 μg总RNA于80µL反应体系，混匀后，1 000 r/min离心30 s，65℃水浴5 min后立即置于冰浴1 min。1 000 r/min离心30 s，冰浴中依次加入：5×First-strand buffer，0.1 mol/L MDTT，RNase抑制剂（40 U/µL）。混匀，25℃孵育10 min，37℃孵育2 min。各管中分别加入4µL M-MLV逆转录酶（200 μL），混匀后短暂离心，37℃水浴50 min。70℃水浴15 min灭活逆转录酶活性终止反应，–20℃保存样品cDNA。

1.3.3 Real-time PCR 试验流程参照参考文献[4]。IE及pp67基因的PCR引物设计见表2。PCR循环参数：95℃预变性60 s；95 ℃ 10 s、退火温度58 ℃ 10 s、72 ℃ 20 s，进行40个循环。温度变化速度为20℃/s，在每个循环的延伸末检测荧光信号。随后是一个缓慢升温的程序：65℃15 s，95℃10 s，温度变化速度为0.1℃/s，同时连续检测DNA逐渐变化过程中荧光信号的变化情况，绘制PCR产物的熔解曲线（melting curve），以了解样品扩增的特异性，保障测定结果的准确可靠。本研究中将各待测基因的PCR扩增CT值与相对应的βactin的PCR扩增CT值相减得到△CT来进行标准化，以2-△CT计算得出各待测基因产物的相对定量，每管样品重复测定3次。根据基因相对表达量，样本IE及pp67的相对表达数值高于对照组5倍以上被认为是高表达，5倍以下被认为是低表达。

Tab.2 Primers for real-time PCR表2 引物序列

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，比较采用t检验。计数资料以例（%）表示，行χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基线资料 传统方法检测TBIL、DBIL、ALT、ALP和HCMV-DNA拷贝数阳性组均高于阴性组（P＜0.01），见表1。

2.2 IE mRNA及pp67mRNA在常规诊断HCMV阳性和阴性患儿中的表达 常规诊断的阴性组中亦有IE mRNA阳性表达患者，但阳性率显著低于阳性组，差异有统计学意义，见表3。

Tab.3 IE and pp67 transcription in the infants who were CMV positive with current clinic standards表3 2组间IE及pp67 mRNA阳性表达结果例（%）

2.3 IE及pp67 mRNA表达在常规诊断HCMV阳性患儿中的分布规律 105例阳性患儿中，72例IE高表达，33例IE低表达。IE与pp67表达呈现交错进行的表达趋势，即IE表达升高，pp67表达呈现较低的状态，见表4。

2.4 IE及pp67 mRNA表达在常规诊断HCMV阴性患儿中的分布规律 HCMV阴性组患儿中尽管也检测到IE的表达（0.23±0.03），但是表达量显著低于IE低表达组（1.03±0.14），差异有统计学意义（t=4.215，P＜0.05）。阴性组患儿未检测到pp67的表达。

Tab.4 Relative mRNA transcription profile of IE and pp67 genes in the HCMV-positive samples diagnosed by routine method表4 阳性组患儿中IE及pp67基因mRNA相对表达量比较

3 讨论

本研究主要对来我院就诊的常规诊断HCMV阳性或阴性患儿血液中的HCMV转录产物表达进行分析，结果表明，病毒转录早期和晚期的mRNA均在阳性患儿中表达，部分患儿就诊时体内已经出现pp67 mRNA表达，提示已经处于病毒感染晚期。在传统检测阴性的患儿中，笔者也检测到有IE mRNA的表达，说明现有诊断方法的灵敏度不足，提示这部分患儿也应该进行适当的治疗。

目前我国婴幼儿感染HCMV的传统诊断方法是基础病毒DNA扩增的检测手段，判断是否感染该病毒。但是传统的DNA扩增手段只能通过明确基因拷贝数的多少来判断感染情况，对于早期感染及病毒复制情况，并无法进行有效地判断，影响了疾病的治疗。因此，目前开发新的检测手段是国际该领域的研究热点[5-6]。

在既往研究中，IE mRNA和pp67 mRNA检测已经在肾脏移植后是否出现HCMV感染鉴定中被应用。研究发现，IE mRNA出现时间显著早于pp67 mRNA，提示IE mRNA是早期发现HCMV感染，并作出诊疗方案的重要依据[7]。同时，Pairoj等[8]发现，利用PCR方法检测pp67的表达，较传统的DNA-PCR方法更为敏感。Bergallo等[9]发现利用荧光定量PCR在HCMV-DNA拷贝数在100个时即可检测到。上述研究结果与笔者的结果是一致的，表明mRNA检测对于判断HCMV感染更加准确和灵敏。但不同的是，本研究利用了两种mRNA共表达的检测手段，通过分析每一种mRNA的相对表达量，达到更加准确地判断HCMV感染时期的目的。

[1]Huang ZR,Yu LP,Yang XC,et al.Human cytomegalovirus linked to stroke in a Chinese population[J].CNS Neurosci Ther,2012,18(6):457-460.doi:10.1111/j.1755-5949.2012.00326.x.

[2]Demirel G,Celik IH,Canpolat FE,et al.Cytomegalovirus infection in preterm triplets transmitted via breast milk[J].J Trop Pediatr,2014,60(2):168-170.doi:10.1093/tropej/fmt087.

[3]Merlino C,Bergallo M,Gregori G,et al.HCMV pp67-mRNA detec⁃tion by nucleic acid sequence-based amplification in renal trans⁃plant patients[J].New Microbiol,2002,25(1):1-8.

[4]Ozbek SM,Ozbek A,Yavuz MS.Detection of human cytomegalovi⁃rus and Epstein-Barr Virus in symptomatic and asymptomatic api⁃cal periodontitis lesions by real-time PCR[J].Med Oral Patol Oral Cir Bucal,2013,18(5):e811-816.doi:10.4317/medoral.18905.

[5]Waters A,Jennings K,Fitzpatrick E,et al.Incidence of congenital cytomegalovirus infection in Ireland:implications for screening and diagnosis[J].J Clin Virol,2014,59(3):156-160.doi:10.1016/j.jcv.2013.12.007.

[6]Gurtler V,Mayall BC,Wang J,et al.The increased sensitivity of hu⁃man cytomegalovirus(HCMV)PCR quantitation in whole blood af⁃fects reproductive rate(Ro)measurement[J].J Virol Methods,2014,196(2):179-184.doi:10.1016/j.jviromet.2013.10.043.

[7]Gerna G,Baldanti F,Lilleri D,et al.Human cytomegalovirus imme⁃diate-early mRNA detection by nucleic acid sequence-based am⁃plification as a new parameter for preemptive therapy in bone mar⁃row transplant recipients[J].J Clin Microbiol,2000,38(5):1845-1853.doi:0095-1137/00/$04.0010.

[8]Pairoj W,Srichunrusami C,Chantratita W,et al.Preliminary report for the application of nucleic acid sequence-based amplification in detection of human cytomegalovirus(HCMV)late pp67 mRNA for diagnosis of HCMV infection[J].J Med Assoc Thai,2000,83(S1):S28-34.

[9]Bergallo M,Costa C,Tarallo S,et al.Development of a quantitativecompetitive PCR for quantification of human cytomegalovirus load and comparison with antigenaemia,viraemia and pp67 RNA detec⁃tion by nucleic acid sequence-based amplification[J].Panminerva Med,2006,48(2):119-127.