HPLC法测定患者血浆中氯吡格雷的羧酸代谢产物浓度

刘丽娜，夏泉，黄燕，许杜娟1，#（1.安徽医科大学药学院，合肥3003；.安徽医科大学第一附属医院药剂科，合肥 3003；3.国家中医药管理局中药化学三级实验室，合肥 3003）

氯吡格雷（Clopidogrel）（结构式见图1 A）是一种新型的噻吩并吡啶类衍生物，具有抗血小板聚集作用及抗血栓形成作用。其作用机制是通过选择性地与血小板表面ADP受体结合来抑制血小板的聚集，目前已被广泛应用于冠脉支架植入（PCI）术中、术后以预防急、慢性血栓形成[1]。氯吡格雷为前体药，在体内约有85%被水解成无活性的羧酸氯吡格雷（CCA，结构式见图1 B），而不足15%被代谢为活性的硫醇衍生物。此前药及其活性硫醇衍生物极不稳定，且浓度极低，在血浆中用常规检测方法很难检测到[2]。CCA相比其前体药和活性代谢产物，是氯吡格雷在体内的主要组成部分，常用于做氯吡格雷的生物等效性及药动学研究[2-4]。本研究旨在建立用高效液相色谱-紫外（HPLC-UV）法测定人血浆中CCA的浓度，该方法具有简便、准确、灵敏度高等优点，为临床应用及个体化治疗方案提供参考。

1 材料

1.1 仪器

图1 氯吡格雷及CCA结构式A.氯吡格雷；B.CCAFig 1 Chemical structures of clopidogrel and carboxylic acid metabolite of clopidogrelA.clopidogrel；B.carboxylic acid metabolite of clopidogrel

Ailgent 1100高效液相色谱系统，配DAD-G1315 B检测器、1100色谱工作站（美国Ailgent公司）；AB135-5电子天平（上海梅特勒多-托利多公司）；XW-80 A旋转振荡器（上海医科大学仪器厂）；TGL-185高速冷冻离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）。

1.2 药品与试剂

CCA对照品（加拿大TRC公司，含量：98%，批号：3-JHY-32-3）；内标：苯妥英钠对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100210-200401）。甲醇、乙睛为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。健康人血浆由安徽医科大学第一附属医院检验科提供，CCA血浆样品取自安徽医科大学第一附属医院门诊及住院服用氯吡格雷的患者。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：0.05 mol/L磷酸二氢钾（三乙胺调pH至5.7）-乙腈（78∶22）；流速：1.0 ml/min；柱温：50℃；紫外检测波长：220 nm；进样量：20µl。

2.2 储备液的配制

分别准确称取CCA对照品和苯妥英钠对照品适量，用甲醇溶解并稀释，配制成浓度为100 μg/ml的储备液，置于4℃冰箱中保存备用。

2.3 血浆样品预处理

精密吸取患者血浆200µl，置于1.5 ml具塞圆底塑料离心管中，加内标苯妥英钠储备液10µl，涡旋混匀2 min，加6%高氯酸50µl涡旋混匀2min。以离心半径为8cm、14000r/min离心10 min，取上清液再次以离心半径为8 cm、14000 r/min离心10 min，取上清液置于进样瓶中，进样20µl。

2.4 色谱行为

在“2.1”项色谱条件下，CCA和苯妥英钠的保留时间分别为7.6、19.8 min。CCA和苯妥英钠与血浆中其他组分色谱峰分离良好，理论板数为3000，分离度（R）＞1.5，色谱见图2。

图2 高效液相色谱图A.空白血浆；B.空白血浆+CCA+苯妥英钠；C.患者血浆；1.CCA；2.苯妥英钠Fig 2 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+CCA+phenytoin sodium；C.plasma；1.CCA；2.phenytoin sodium

2.5 标准曲线及线性范围考察

用空白血浆将CCA储备液稀释成0.10、0.25、0.5、1、2、4、8 μg/ml的系列溶液。按“2.3”项下方法处理并测定，记录色谱。以血药浓度（x）为横坐标、所测药物与内标峰面积的比值（y）为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程为：y＝0.1499 x+0.0551（r＝0.9995）。结果表明CCA血药浓度在0.10～8.0 μg/ml范围内线性关系良好，最低检测限为0.05 μg/ml。

2.6 精密度试验

分别配制0.5、2.0、4.0 μg/ml的CCA低、中、高3种质量浓度的含对照品血浆，每一质量浓度平行操作5份，于同日内按“2.3”项方法操作后进样分析，计算日内精密度；连续5 d按此法操作，综合5d的数据计算日间精密度。CCA日内、日间RSD均小于10%，方法精密度良好，结果见表1。

2.7 回收率试验

2.7.1 方法回收率：分别配制0.5、2.0、4.0 μg/ml的CCA低、中、高3种质量浓度的含对照品血浆，按“2.3”项下方法操作，每一浓度平行操作5份后进样分析，代入回归方程计算浓度，以测得量和加入量的比值计算方法回收率。结果CCA的方法回收率在99.7%～100.2%之间，确保了定量的准确性和可靠性，见表1。

2.7.2 提取回收率：分别配制0.5、2.0、4.0μg/ml的CCA低、中、高3种质量浓度的含对照品血浆，按“2.3”项下方法操作，每一浓度平行操作5份后进样分析。另配制与血浆中相同浓度的CCA对照品溶液，与样品中含量相等的CCA比较，记录峰面积计算提取回收率。结果提取回收率均大于75%，见表1。

表1 精密度与回收率试验结果（n＝5）Tab 1Results of precision and recovery tests（n＝5）

上述结果表明，日内、日间RSD均小于3%，平均方法回收率在99.7%～100.2%之间，平均提取率均大于75%。该方法适用于本品血药浓度检测和药动学研究。

2.8 冻融稳定性试验

用空白血浆配制0.5、2.0、4.0 μg/ml的CCA低、中、高3种质量浓度的含对照品样品，在－40℃冰箱中冷冻后取出，在0、24、48、72h后按“2.3”项下方法测定CCA的浓度。结果CCA低、中、高3种质量浓度测得值的RSD分别为1.0%、2.1%、1.18%，稳定性RSD均小于10%，表明样品在－40℃条件下稳定。

2.9 患者血药浓度检测

从门诊及住院病房共收集到15例PCI术后规律服用氯吡格雷75 mg/d超过7 d的患者，患者在当天早上服药后3 h时采集血样测其CCA血药浓度，结果见表2。

表2 患者CCA血药浓度测定结果Tab 2 Plasma concentration results of CCAin patients

3 讨论

本研究建立了以HPLC-UV法测定血浆中羧酸氯吡格雷的浓度，方法专属性高，方法回收率在99.7%～100.2%之间，提取回收率超过75%，稳定性RSD均小于10%，符合药动学和生物等效性的要求[2-4]。因此测定CCA的血药浓度可以对研究氯吡格雷体内过程以及指导氯吡格雷进行个体化给药提供帮助。

氯吡格雷羧酸代谢产物的测定方法目前有HPLC法及液-质联用（LC-MS/MS）法等。本研究使用HPLC法，其中流动相中用三乙胺调pH可增加仪器灵敏度。试验过程中曾比较二氯甲烷、正乙烷、乙醚、6%高氯酸萃取CCA，发现6%高氯酸萃取率最高。与文献报道[4]方法相比，本法具有以下特点：（1）样品预处理较为简单；（2）和文献中1.7 ml/min的流速相比，该研究流速较低从而使CCA和血浆中杂质峰充分分离。

氯吡格雷药物体内药动学过程中，其吸收和代谢过程受ATP结合盒（ABCB）1及细胞色素P450酶（CYP）酶单核苷酸多态性（SNP）的影响，基因分型不同其CCA的血药浓度也有所差别。另合并用药的相互作用、年龄、体质量，患者生活习惯及肝肾功能也会影响其血液浓度[5]。

[1]Jolanta M，Siller-Matula，Katrin Haberl，et al.The effect of antiplatelet drugs clopidogrel and aspirin is less immediately after stent implantation[J].Thrombosis Research，2009，123（6）：874.

[2]Zydus Research Centre，Bioanalytical and DMPK Department，Sarkhej-Bavla N.H.Estimation of carboxylic acid metabolite of clopidogrel in Wistar rat plasma by HPLC and its application to a pharmacokinetic study[J].Journal of Chromatography B，2005，25（821）：173.

[3]Robinson A，Hilis J，Neal C，et al.The validation of a bioanalytical method for the determination of clopidogrel in human plasma[J].Journal of Chromatography B，2007，27（848）：344.

[4]Bahrami G，Mohammadi M，Sisakhtnezhad S，et al.Highperformance liquid chromatographic determination of inactive carboxylic acid metabolite of clopidogrel in human serum：application to a bioequivalence study[J].Journal of Chromatography B，2008，28（864）：168.

[5]Zhou HM，Meng S，Zhao J，et al.Influence of genetic and non-genetic factors on the plasma concentrations of the clopidogrel metabolite（SR26334）among Chinese patients[J].Clinica Chimica Acta，2013，416（1）：50.