TBX1基因在常染色体显性遗传性多囊肾肾组织中的表达及意义

姜红堃，郭燕平，李雷，姜红，白英龙

（1.中国医科大学附属第一医院儿科，沈阳 110001；2.中国医科大学附属盛京医院骨科，沈阳 110003；3.中国医科大学公共卫生学院儿少卫生学教研室，沈阳 110001）

常染色体显性遗传性多囊肾（autosomal domi⁃nant polycystic kidney disease，ADPKD）是一种常见的遗传性肾病，发生率为活产新生儿的0.1%～0.25%，是导致肾功能衰竭的主要病因之一［1］。其发生机制十分复杂，涉及多种基因表达及蛋白质功能异常，迄今尚未明确。肾小管分化增生异常是肾囊性病变的主要原因之一［1～3］。人类TBX1基因（Gene ID：6899）定位于22q11.21，为染色体22q11.2微缺失中重要基因［4］。课题组前期研究发现，胚胎肾发育过程中TBX1在肾小管中高表达，发育成熟后表达微弱；而急性肾小管损伤时表达再次升高，提示该基因可能与肾小管发育及损伤修复密切相关［5］。本研究拟通过检测ADPKD患者多囊肾组织TBX1 mRNA及蛋白表达，探讨TBX1基因在ADPKD发病中的潜在机制，为产前诊断及遗传干预提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

多囊肾组织标本11例，来自本院2009年至2013年明确诊断为ADPKD患者并经手术切除的多囊肾组织，男7例，女 4例，年龄（43±5.3）岁。对照组肾组织标本7例，来自本院2010年至2013年外科切除的正常肾组织，男4例，女3例，年龄（46±3.5）岁。所留取肾组织部分置于经焦炭酸二乙酯（pyro carbonic acid diethyl ester，DEPC）处理过的EP管中，马上转移至-80冰箱保存待检；部分置于多聚甲醛溶液（4 g/L）中固定、包埋。本研究的标本使用均经受试对象知情并签字同意，经本院学术伦理委员会讨论通过。

1.2 实时定量聚合酶链反应（qRT＆x100ccf;PCR）检测肾组织TBX1 mRNA表达

1.2.1 引物设计与合成：TBX1：上游5′＆x100ccf;ACGACAACGGCCACATTATTC ＆x100ccf; 3′，下游5′＆x100ccf; CCTCGGCATATTTCTCGCTATCT＆x100ccf;3′，产物长度102 bp。内参β＆x100ccf;actin：上游5′＆x100ccf; GCCCTGGATTTTGAGAATGA ＆x100ccf;3′，下游5′＆x100ccf; ATGCCAGCAGATTCCATACC ＆x100ccf;3′，产物长度155 bp。以上引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 总RNA提取及cDNA合成：利用Trizol RNA抽提试剂盒提取RNA（美国Invitrogen公司），经紫外分光光度计检测吸光度（A260/280）比值，获得RNA浓度和纯度，并经电泳检测RNA分子完整性。高速低温离心机由美国Beckman公司提供；用反转录试剂盒（大连宝生物有限责任公司）将总RNA反转录成cDNA第一链，反应总体积为20 L，反应条件为：4260 min，995 min，45 min。cDNA置于-20冰箱保存备用。

1.2.3 qPCR反应：采用SYBR Green PCR Master mix（美国Applied Biosystems公司）染料法进行TBX1基因qPCR扩增，反应体系如下：cDNA 1.0 L，2×SYBR Green PCR Master mix 25 L，引物（上下游引物的终浓度各为900 nmol/L）2.0 L，ddH2O 22.0 L。反应条件：50°C 2 min → 95°C 10 min →（92°C 15 s→ 56.5°C 1 min）×40个循环。以β＆x100ccf;actin为内参，校正每个样本的Ct，采用thermal cycler软件包计算Ct值，以2-计算基因转录表达水平。荧光定量实时PCR仪（7500型）由美国Applied Biosystems公司提供。

1.3 Western blot检测肾组织TBX1蛋白表达

1.3.1 肾组织总蛋白的提取：取冷冻备用的肾组织100 mg，加入1 mL蛋白裂解液，于冰上超声波粉碎机下将组织粉碎，电动匀浆，离心后取上清；按照蛋白抽提试剂盒（美国Active Motif公司）使用说明进行蛋白抽提，应用Bradford法测定蛋白质含量。

1.3.2 电泳及转膜：将40 μg蛋白抽提物加样于十二烷基硫酸钠＆x100ccf;聚丙烯酰胺凝胶中电泳4 h，后转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（美国Amersham公司）。

1.3.3 杂交及显色：取下PVDF膜，脱脂奶（50 g/L）封闭膜1 h，加入山羊源性TBX1或β＆x100ccf;actin抗体（1∶1 000稀释，美国Santa Cruz公司），室温孵育1 h。TBST洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG抗体（1∶1 000稀释，美国Santa Cruz公司），室温孵育1 h。TBST洗涤后加入ECL显色试剂（美国Amersham公司），曝光于Kodak胶片。应用凝胶图像扫描仪（美国gene公司）进行定量分析。

1.4 免疫组织化学分析检测肾组织TBX1蛋白表达

将新鲜肾组织放入多聚甲醛溶液（4 g/L）中固定24 h，常规方法脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，加入山羊源性TBX1抗体（1∶200稀释，美国Santa Cruz公司），37孵育1～2 h，加入兔抗羊IgG抗体（1∶200稀释，美国Santa Cruz公司），37湿盒中孵育30 min，用DAB显色液进行显色，脱水、透明、封片，光学显微镜下检测染色结果，用PBS代替一抗作阴性对照。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 qRT＆x100ccf;PCR检测分析结果

qRT＆x100ccf;PCR结果表明ADPKD多囊肾肾组织TBX1 mRNA表达水平较对照组明显增强，差异有统计学意义（t=8.582，P=0.000，表1）。

2.2 Western blot检测分析结果

Western blot结果表明ADPKD多囊肾肾组织TBX1蛋白表达水平较正常对照组增强，差异有统计学意义（t=9.625，P=0.000，表1，图1）。

2.3 免疫组织化学检测分析结果

免疫组织化学检测结果表明TBX1在对照组肾组织的肾小管上皮细胞中呈微量表达；而在多囊肾囊肿组织上皮细胞中呈较强阳性表达，肾囊肿组织中可见肾小管囊性扩张，肾间质纤维化（图2）。

图1 Westernblot检测多囊肾组与对照组肾组织TBX1蛋白表达Fig.1 TBX1 protein expression was assayed by Western blot

3 讨论

多囊肾病是最常见的遗传性肾脏疾病之一，分为常染色体显性遗传和常染色体隐性遗传，其中ADPKD较多见。ADPKD生后即已存在，但多于40～50岁才出现症状，故又称成人型多囊肾［6］。ADPKD临床表现为腰痛、高血压、尿路感染、血尿及肾结石，最终发展为肾功能衰竭，约占终末期肾衰病因的5%～10%。此外常合并肝、胰、脾、松果体、精囊、肺等肾外的多器官囊肿，ADPKD肾脏有多个囊肿形成并进行性增大［7］。本实验在ADPKD患者肾囊肿组织中可见肾小管囊性扩张，肾间质纤维化，囊间肾单位萎缩，为典型多囊肾病理表现。

表1 多囊肾组与对照组肾组织TBX1 mR NA及蛋白表达水平比较（±s）Tab.1 Expression of TBX1 mRNA or protein level in kidney tissues of the two groups（±s）

表1 多囊肾组与对照组肾组织TBX1 mR NA及蛋白表达水平比较（±s）Tab.1 Expression of TBX1 mRNA or protein level in kidney tissues of the two groups（±s）

Group n Age（years） TBX1 mRNA TBX1 protein Control 7 46±3.5 1.00±0.02 1.00±0.06 ADPKD 11 43±5.3 12.36±1.15 17.18±2.53

图2 免疫组化检测多囊肾组与对照组肾组织TBX1蛋白表达 bar=20μmFig.2 TBX1 protein expression was assayed by Immunohistochemistry bar=20μ

ADPKD肾组织囊肿发生发展的病理生理机制基本相同，主要包括：肾小管上皮细胞过度增生及异常分化；细胞因子、生长因子及趋化因子等物质的增多，导致非感染性肾间质纤维化；细胞外基质低分子量糖蛋白、纤维蛋白及型胶原蛋白增多，导致基膜顺应性改变，囊肿内液体异常积聚，肾小管囊肿形成并进行性增大［2］。研究表明，的异常分泌及其受体高表达可以促进ADPKD肾组织囊的产生及其相关信号分子可能成为ADPKD的生物标识物及治疗靶标［8］。体外研究及动物实验表明，RAGE基因功能被阻滞后可降低ADPKD模型鼠多囊肾组织囊的发生及扩大，病变肾脏体积及重量明显降低，尿素氮及肌酐水平逐渐降低［9］。Wnt7a、Wnt7b及基因过表达可导致肾囊性病变的发生及增殖［10，11］。囊性肾病模型小鼠胚胎肾组织96表达明显异常［12］。

人类TBX1基因是T＆x100ccf;box转录因子家族成员，后者在种系发生及进化过程中趋于保守，成员均包含一个相同的DNA结合域，即T＆x100ccf;box。TBX1基因是已知在胚胎发育中发挥重要作用的转录因子，为调控咽弓、动脉弓、心脏流出道及间隔正常形成的关键基因，参与心脏、耳、甲状腺、胸腺、牙齿等多种组织和器官的发育过程，在精神疾病发病中亦扮演一定角色［13～19］。目前国内外围绕TBX1基因的研究多集中于其与心脏畸形的关系，而对于该基因与肾脏发育与疾病的研究较少。研究证实缺乏Shh基因的小鼠中，TBX1 mRNA表达明显下调［20］；而Shh基因缺失可导致转基因鼠后肾间充质发育异常，将脊索及底板的Shh基因灭活后可导致肾脏融合出现蹄形肾［21］。另有研究表明，TBX1基因在胚鼠肾脏发育中呈波动表达，其蛋白与HOXD10相互作用参与肾脏发育［22］。

课题组前期研究发现，在庆大霉素诱导的急性肾小管损伤模型鼠中，肾小管上皮细胞TBX1基因表达明显增强，提示该基因可能参与肾小管上皮的损伤修复过程［5］。本研究实时定量PCR及Western blot检测结果显示，ADPKD多囊肾肾组织TBX1 mRNA及蛋白表达较对照组均显著增强。此外免疫组织化学分析结果显示，TBX1蛋白在对照组肾组织肾小管上皮细胞中呈微量阳性表达，而在多囊肾囊肿组织上皮细胞中呈较强阳性表达，与囊肿发生发展的病理生理机制相契合。由此推测TBX1基因可能参与肾小管上皮细胞的增殖与分化，其过量表达可能促进肾小管上皮细胞过度增殖，从而导致囊肿的发生及增大。TBX1基因表达异常可能是其参与肾脏囊性病变发生发展的潜在分子机制之一。

［1］Neumann HP，Jilg C，Bacher J，et al.Epidemiology of autosomal⁃dominant polycystic kidney disease：an in⁃depth clinical study for south⁃western Germany.Else⁃Kroener⁃Fresenius⁃ADPKD⁃Regis⁃try［J］.Nephrol Dial Transplant，2013，28（6）：1472-1487.

［2］Mochizuki T，Tsuchiya K，Nitta K.Autosomal dominant polycystic kidney disease：recent advances in pathogenesis and potential ther⁃apies［J］.Clin Exp Nephrol，2013，17（3）：317-326.

［3］Czarnecki PG，Steinman TI.Polycystic kidney disease：new hori⁃zons and therapeutic frontiers［J］.Minerva Urol Nefrol，2013，65（1）：61-68.

［4］Gao S，Li X，Amendt BA.Understanding the role of Tbx1 as a can⁃didate gene for 22q11.2 deletion syndrome［J］.Curr Allergy Asth⁃ma Rep，2013，13（6）：613-621.

［5］Jiang H，Li L，Li⁃Ling J，et al.Increased Tbx1 expression may play a role via TGFβ⁃Smad2/3 signaling pathway in acute kidney injury induced by gentamicin［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7（4）：1595-1605.

［6］Obeidova L，Elisakova V1，Stekrova J，et al.Novel mutations of PKD genes in the Czech population with autosomal dominant poly⁃cystic kidney disease［J］.BMC Med Genet，2014，15（1）：41.

［7］Helal I.Autosomal dominant polycystic kidney disease：new in⁃sights into treatment［J］.Saudi J Kidney Dis Transpl，2013，24（2）：230-234.

［8］Li EJ，Song SA，Mun HW，et al.Blockade of IL⁃8 receptor signal⁃ing inhibits cyst development in vitro，via suppression of cell pro⁃liferation in autosomal polycystic kidney disease［J］.Nephrology（Carlton），2014，19（7）：Epub ahead of print doi：10.1111/nep.12261.

［9］Park EY，Kim BH，Lee EJ，et al.Targeting of receptor for ad⁃vanced glycation end products suppresses cyst growth in polycys⁃tic kidney disease［J］.J Biol Chem，2014，289（13）：9254-9262.

［10］Qin S，Taglienti M，Cai L，et al.c⁃Met and NF⁃κB⁃dependent overexpression of Wnt7a and ⁃7b and Pax2 promotes cystogene⁃sis in polycystic kidney disease［J］.J Am Soc Nephrol，2012，23（8）：1309-1318.

［11］Stayner C，Iglesias DM，Goodyer PR，et al.Pax2 gene dosage in⁃fluences cystogenesis in autosomal dominantpolycystic kidney disease［J］.Eccles MR Hum Mol Genet，2006，15（24）：3520-3528.

［12］Ben⁃Dov IZ，Tan YC，Morozov P，et al.Urine microRNA as po⁃tential biomarkers of autosomal dominantpolycystic kidney dis⁃ease progression：description of miRNA profiles at baseline［J］.PLoS One，2014，9（1）：e86856.

［13］Chen M，Yang YS，Shih JC，et al.Microdeletions/duplications in⁃volving TBX1 gene in fetuses with conotruncal heart defects which are negative for 22q11.2 deletion on fluorescence in⁃situ hybridization［J］.Ultrasound Obstet Gynecol，2014，43（4）：396-403.

［14］Fagman H，Nilsson M.Morphogenetics of early thyroid develop⁃ment［J］.J Mol Endocrinol，2011，46（1）：R33-42.

［15］Radosevic M，Robert⁃Moreno A，Coolen M，et al.Her9 represses neurogenic fate downstream of Tbx1 and retinoic acid signaling in the inner ear［J］.Development，2011，138（3）：397-408.

［16］Cao H，Florez S，Amen M，et al.Tbx1 regulates progenitor cell proliferation in the dental epithelium by modulating Pitx2 activa⁃tion of p21［J］.Dev Biol，2010，347（2）：289-300.

［17］Wang H，Chen D，Ma L，et al.Genetic analysis of the TBX1 gene promoter in ventricular septal defects［J］.Mol Cell Biochem，2012，370（1⁃2）：53-58.

［18］Guo T，McDonald⁃McGinn D，Blonska A，et al.Genotype and cardiovascular phenotype correlations with TBX1 in 1，022 velo⁃cardio ⁃facial/DiGeorge/22q11.2deletion syndrome patients［J］.Hum Mutat，2011，32（11）：1278-1289.

［19］Hiramoto T，Kang G，Suzuki G，et al.Tbx1：identification of a 22q11.2 gene as a risk factor for autism spectrum disorder in a mouse model［J］.Hum Mol Genet，2011，20（24）：4775-4785.

［20］Yamagishi H，Maeda J，Hu T，et al.Tbx1 is regulated by tissue⁃specific forkhead proteins through a common sonic hedgehog⁃re⁃sponsive enhancer［J］.Genes Dev，2003，17（2）：269-281.

［21］Tripathi P，Guo Q，Wang Y，et al.Midline signaling regulates kid⁃ney positioning but not nephrogenesis through Shh［J］.Dev Biol，2010，340（2）：518-527.

［22］Fu Y，Li F，Zhao DY，et al.Interaction between Tbx1 and Hoxd10 and connection with TGFβ⁃BMP signal pathway during kidney development［J］.Gene，2014，536（1）：197-202.