乙葵冲剂对雷公藤致雌鼠生殖系统毒性的预防作用

程吉东，温淑云，杨大男

(德州市人民医院，山东德州253014)

雷公藤作为一种植物药，在临床被广泛应用于风湿免疫性疾病，疗效肯定，但同时存在明显的毒副作用。临床及实验证实，雷公藤对生殖系统有较大影响，如导致女性月经紊乱或闭经、卵巢早衰，男性精子数量减少或无精子产生、不育，从而限制了其临床应用范围［1］。2014年1～6月，我们观察了乙葵冲剂对雷公藤致雌鼠生殖系统毒性的影响，旨在为临床提供减毒用药的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 雌性SD小鼠40只，7～8周龄，由德州学院实验动物房提供。雷公藤多苷片:国药准字Z33020422，由浙江得恩德制药有限公司提供，10 mg/片。乙葵冲剂为自拟中药方，由生地15 g、熟地15 g、肉苁蓉30 g、山药20 g、茯苓15 g、泽泻15 g、菟丝子30 g、仙灵脾15 g、知母12 g、山萸肉9 g、丹参10 g、甘草6 g组成，药物由单味中药颗粒(广州一方制药有限公司生产)配置成混悬液灌胃(相当于成人量的15倍)。

1.2 实验动物分组及处理 实验前对每只雌性小鼠做阴道涂片10 d，选出连续2次为期4～5 d的正常性动周期小鼠30只，随机分三组各10只，空白对照组不用任何药物，雷公藤组给予雷公藤40 mg/(kg·d)，乙葵冲剂组给予雷公藤40 mg/(kg·d)加乙葵冲剂10 g/(kg·d)。三组均喂养90 d。实验开始及结束10 d逐日做阴道涂片，以观察脱落细胞，目的是选取正常性动周期动物(4～5次/d)、确定采血时间和观察用药后性动周期的变化。

1.3 血清孕酮(P)、促黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)、促卵泡激素(FSH)检测 实验前后各采血1次，时间在动情前期，由球后静脉取血。采用ELISA法，试剂盒由上海江莱生物科技有限公司提供，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.4 阴道、子宫湿重计算及子宫、卵巢形态学观察 对小鼠采取乙醚麻醉，剖腹，取卵巢、子宫、阴道，以10%甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色。取子宫及阴道，以分析天平称重，计算各组织脏器系数(脏器重量g/100 g体质量)。卵巢以4%多聚甲醛+0.5%戊二醛混合液中固定。材料修块后经1%锇酸固定2 h，制半薄切片(1 μm)，用瑞士吉姆萨染色定位，修块后做80～100 nm超薄切片，行醋酸铀、枸橼酸铅双重染色，透射电镜观察。组织称重法计算卵巢、子宫指数，病理切片观察各时段卵巢、子宫组织形态学变化。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组用药前后血清 P、LH、E2、FSH水平比较结果见表1。

2.2 各组用药前后阴道、子宫湿重比较 结果见表2。

表1 各组用药前后血清P、LH、E2、FSH水平比较(±s)

表1 各组用药前后血清P、LH、E2、FSH水平比较(±s)

注:与同组用药前比较，﹟ P ＜0.05，*P ＜0.01;与雷公藤组比较，△P ＜0.05

组别 P(mIU/mL)LH(mIU/mL)E2(pmol/L)FSH(mIU/mL)6.39 ±1.33乙葵冲剂组用药前 65.07 ±28.75 6.47 ±1.94 3.31 ±0.63 6.37 ±1.74用药后 32.92 ±15.1＊△8.97 ±3.38﹟ 6.96 ±0.62＊△7.36 ±1.83雷公藤组用药前 71.06 ±26.52 5.15 ±1.75 3.71 ±0.53 4.96 ±1.37用药后 11.54 ± 3.25*7.26 ±2.83﹟ 1.21 ±0.33* 5.73 ±0.83空白对照组用药前 57.86 ± 0.25 5.00 ±2.40 3.33 ±0.61 5.23 ±1.57用药后 53.61 ± 0.57△ 6.11 ±3.10 3.37 ±0.65△

表2 各组用药前后阴道、子宫湿重比较(g，±s)

表2 各组用药前后阴道、子宫湿重比较(g，±s)

注:与同组用药前比较，*P＜0.01;与空白对照组比较，△P＜0.01

组别 阴道湿重 子宫湿重0.011 ±0.002 0.020 ±0.003乙葵冲剂组用药前 0.012 ±0.002 0.022 ±0.004用药后 0.031 ±0.003＊△ 0.041 ±0.003＊△雷公藤组用药前 0.013 ±0.001 0.025 ±0.002用药后 0.002 ±0.001＊△ 0.011 ±0.005＊△空白对照组用药前 0.012 ±0.001 0.021 ±0.005用药后

2.3 各组小鼠子宫、卵巢形态学比较 结果见图1～6。空白对照组雌鼠子宫内膜厚，腺体丰富，间质细胞密度中等(图1);卵巢体积大，卵泡生长活跃，可见各级卵泡，颗粒细胞层次多，卵泡液含量多，黄体发育好，体积大，黄体细胞丰富(图4)。雷公藤组雌鼠子宫内膜明显变薄，腺体减少(图2);卵巢体积萎缩，卵泡生长少，部分被纤维组织所代替，黄体数量少(图5)。乙葵冲剂组雌鼠子宫内膜厚，腺体丰富(图3);卵巢体积大，卵泡生长多，颗粒细胞层次多，血供丰富，黄体细胞丰富(图6)。

3 讨论

雷公藤是卫矛科雷公藤属植物，归肝、肾经，味苦辛，性寒，有剧毒。中医学认为其具活血化瘀、清热解毒、消肿散结、祛风除湿等功效，常用于治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征等自身免疫系统疾病，疗效显著。然而，雷公藤广泛应用临床并发挥治疗作用的同时，长期使用该药有明显的生殖毒性，会导致女性月经减少、闭经及男子精子减少、不育等，其生殖毒性日益受到关注［2］。

图1 空白对照组子宫HE染色(20×10)

图2 雷公藤组子宫HE染色(20×10)

图3 乙葵冲剂组子宫HE染色(20×10)

图4 空白对照组卵巢HE染色(10×6)

图5 雷公藤组卵巢HE染色(10×6)

图6 乙葵冲剂组卵巢HE染色(10×6)

目前，已有众多学者对雷公藤生殖毒性进行了大量的实验研究，发现雷公藤制剂能降低子宫及卵巢脏器指数、可造成育龄期大鼠卵泡发育障碍和卵巢功能低下，损害卵巢功能及诱导子宫内膜凋亡基因的表达，使子宫管径细，子宫内膜上皮薄，腺体含量少，子宫肌层变薄，肌纤维排列较稀疏［3，4］。吴克明等［3］发现，雷公藤多苷可造成育龄期大鼠卵泡发育障碍和卵巢功能低下，表现为大鼠动情周期紊乱或消失，卵巢指数下降。于俊生等［4］给予大鼠雷公藤多苷灌胃，病理结果显示其成熟卵泡数、黄体数减少，卵泡和黄体较小，子宫管径细，子宫内膜上皮薄，腺体含量少，子宫肌层变薄，肌纤维排列较稀疏。研究［3］报道，给予大鼠雷公藤多苷40 mg/kg灌胃后应用放射免疫法检测孕酮、雌二醇，结果显示孕酮、雌二醇水平明显下降。周昕欣等［5］认为，雷公藤在病理、生理状态下均能使孕酮降低，促滤泡素升高，促黄体生成素升高。王君等［6］给予小鼠灌服雷公藤多苷后取出卵母细胞，检测卵母细胞的发育情况，并进行体外受精，认为其可明显降低小鼠成熟卵母细胞的体外受精率，对卵母细胞的质量和存活也有显著的破坏作用，提示雷公藤多苷通过降低卵母细胞的受精能力和存活率而影响小鼠的生殖能力。研究［8］报道，雷公藤多苷使Bcl-2基因表达降低，Bax基因表达升高，说明雷公藤可以导致性腺抑制，诱导凋亡基因表达，最终使子宫内膜细胞过度凋亡。

《黄帝内经.素问.六节藏象论篇》曰:“肾者主蛰，封藏之本，精之处也”，可见五脏之中，肾与生殖功能关系最为密切，生殖功能受肾气调控，生殖功能低下当责之于肾虚，肾精、肾气亏虚是生殖功能低下的根源。雷公藤之药毒进入人体后，一方面直接耗伤精血，使脏腑缺乏气化的物质基础，而致脏腑功能失调;另一方面通过损伤脏腑(主要为肾)，使气血津液的生成、输布、排泄障碍，导致湿、痰、瘀、毒留于体内，使损伤更重。因此，雷公藤所致雌性小鼠生殖功能低下当责之于其对肾精、肾气的损伤，肾精肾气亏损，则“肾主生殖”的功能减退。自拟方乙葵冲剂由六味地黄汤加味，六味地黄丸出自《小儿药证直诀》，为宋代钱乙所创，是传统中医“滋阴补肾”的经典名方，使用已近千载。其功效是滋阴补肾，兼益肝阴［8］。现代药理研究认为，乙葵冲剂能改善肾功能，促进肾脏对体内代谢产物尿素等的排泄［9］。方中生熟地、山药、山萸肉、茯苓、泽泻，滋肾阴、养精血;肉苁蓉、菟丝子、仙灵脾温补肾阳，肉苁蓉“主五劳七伤，补中，除茎中寒热，养五脏，强阴益精气，多子”，既能温通肾阳，又能滋养精血［10］。现代研究［11］表明，肉苁蓉具有雄性激素作用和促性腺激素样作用，能发挥调节内分泌腺轴的功能，促进精子发生，使睾丸生精功能增强;生地熟地并用取阴阳平衡之意，与知母、丹参同用使组方补而不热，体现了“善补阴者，必于阳中求阴，则阴得阳升而泉源不竭”的观点，全方的配伍注重寓调节肾的阴阳平衡于补肾之中，以平为期，补阴之中寓有补阳之用，共达补肾精、养精血、化瘀血之功。

本研究显示，乙葵冲剂能增加应用雷公藤小鼠阴道、子宫重量，光镜下雌鼠子宫内膜厚，腺体丰富卵巢体积大，卵泡生长多，颗粒细胞层次多，血供丰富，黄体细胞丰富;孕酮水平下降幅度明显小于雷公藤组;促黄体生成素水平上升，与其他两组比较无差异。说明乙葵冲剂可以拮抗雷公藤多苷对雌鼠生殖系统的毒副作用，对于雌鼠生殖系统具有保护作用，从而为临床提供减毒用药的理论依据，解决临床上由于长期服用雷公藤多苷导致女性月经紊乱、闭经问题。

［1］Gyles CL.Escherichia coli cyloxins and enteroxin s［J］.Can J Microbiol，1992，38(7):734.

［2］阮宁，施毅.雷公藤多甙的毒副作用分析［J］.实用医技杂志，2007，14(26):3687-3688.

［3］吴克明，付雨，吴也可，等.通脉大生片对雷公藤致卵巢损伤大鼠卵巢激素与卵泡发育的影响［J］.成都中医药大学学报，2011，34(3):25-28.

［4］于俊生，王瑶瑶.益肾饮拮抗雷公藤多苷对系膜增生性肾炎雌性大鼠性腺损害的研究［J］.山东中医杂志，2009，28(3):192-194.

［5］周昕欣，梁茂新.基于雷公藤毒性配伍组方对肾病雌性大鼠生殖系统影响的研究［J］.中药药理与临床，2009，25(4):56-58.

［6］王君，于智勇，薛庆於，等.雷公藤多甙对小鼠卵母细胞成熟和体外受精的影响［J］.生物学杂志，2009，26(5):48-50.

［7］毛黎明，殷子杰，王军，等.益肾调经方对雷公藤多苷致性腺抑制的肾病大鼠子宫内膜bcl-2/bax基因表达的影响［J］.中华中医药学刊，2008，26(5):1030-1032.

［8］于世良，史定文.中药名方精解［M］.北京:中医古籍出版社，1993:136.

［9］张艳，刘画建.六味地黄丸的药理研究进展［J］.国医论坛，2004，19(2):50-52.

［10］黄爽辑.神农本草经［M］.北京:中医古籍出版社，1982:73.

［11］陶婷婷，吕伯东，黄晓军.单味中药治疗弱精子症的研究现状［M］.浙江中医药大学学报，2008，32(3):421-422.