肾癌组织中mTOR、P70S6K蛋白的表达变化及意义

刘国斌，单广夷，孔垂泽

(1中国医科大学附属第一医院，沈阳110000;2宽甸中心医院)

肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，占成人恶性肿瘤的2%～3%，且呈逐年上升趋势。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属磷酸肌醇激酶成员，主要控制细胞周期进程，对细胞分化、凋亡起重要作用［1，2］。研究［3］表明，肿瘤中 mTOR表达失调［3］。核糖体蛋白S6激酶(P70S6K)是核糖体40S小亚基S6蛋白激酶，是mTOR的直接作用底物，被mTOR磷酸化后激活，控制含5'-TOP结构的mRNA翻译［4～7］，激活S6从而使核糖体40S小亚基易于结合翻译复合物，促进蛋白质合成。本研究观察了肾癌组织中mTOR、P70S6K蛋白的表达变化，并探讨其意义。

1 材料与方法

1.1 材料 109例肾癌组织均来自中国医科大学附属第一医院2006～2008年手术切除标本。肾癌患者中男51例、女58例，年龄34～81岁、平均53岁。按2004年WHO病理组织学分类，其中透明细胞癌94例，乳头状癌15例。组织学分级:高分化50例，中分化37例，低分化22例。按ROBSON临床分期，Ⅰ期46例，Ⅱ期35例，Ⅲ、Ⅳ期28例。收集距离肿瘤边缘5 cm外的正常肾脏组织20例作为对照，全部标本术前均未接受化疗及放疗，标本离体5 min内经液氮速冻后置-80℃冰箱保存备用，所有组织用10%甲醛固定，常规石蜡包埋。

1.2 主要试剂 mTOR多克隆抗体购于Santa Cruz公司;P70S6K多克隆抗体购于南京有为生物科技有限公司;DAB显色系统购自福州迈新公司;RIPA裂解液﹑GAPDH和β-actin购于碧云天试剂公司;S-P免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥公司。

1.3 mTOR、P70S6K蛋白检测 免疫组化检测:应用SP法进行免疫组化实验，操作按试剂盒说明书进行。以PBS代替一抗作为阴性对照，结果判定:依据染色强度+阳性细胞计数评分。①染色强度分数标准:无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。②阳性细胞数:同样物镜下计数阳性细胞数，1%～10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，75%以上为4分。两项得分相乘，满3分为+，4、5分为++，6分以上为 +++，+～+++为阳性表达。Western blotting实验:提取蛋白，上样电泳，湿转后分别加入一抗mTOR(1∶200)，室温下2 h。加入碱性磷酸酶标记的二抗P70S6K(1∶2 000)，室温下2 h。选取β-actin作为内参照，用ImageJ进行灰度分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较用t检验;计数资料比较用χ2检验，两变量间的相关性检验采用Spearman等级相关分析法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾癌、正常肾组织中mTOR、P70S6K蛋白的表达 mTOR蛋白在肾癌、正常肾组织中的表达水平分别为1.223 ±0.125、0.667 ±0.106，两者比较，P＜0.01;P70S6K在肾癌、正常肾组织的表达水平分别为 1.108 ±0.258、0.489 ±0.21，两者比较，P ＜0.01。高、中、低分化肾癌中mTOR蛋白的表达分别为 0.72 ± 0.01、0.91 ± 0.07、1.24 ± 0.13，P70S6K蛋白的表达分别为 0.57 ±0.01、0.79 ±0.01、1.13±0.01。mTOR、P70S6K蛋白在肾癌各组织学分级间的表达差异均有统计学意义(P均＜0.01)。

2.2 mTOR、P70S6K蛋白表达与肾癌临床病理参数的关系 mTOR蛋白定位于细胞质，细胞膜中亦有着色，在109例肾癌组织中有87例阳性表达，表达率为79.8%。P70S6K蛋白定位于细胞质，在109例肾癌组织中90例阳性表达，表达率为82.6%。mTOR、P70S6K蛋白阳性表达与肾癌的组织分化程度、淋巴结转移和临床分期有关(P均＜0.05)，与患者性别、年龄无关(P均＞0.05)。详见表1。

表1 mTOR、P70S6K蛋白表达与肾癌临床病理参数的关系

2.3 肾癌组织中mTOR与P70S6K蛋白表达的相关性 在87例mTOR蛋白表达阳性的肾癌组织中有84例P70S6K蛋白表达阳性，阴性表达有3例。而在22例mTOR蛋白表达阴性的肾癌组织中有16例P70S6K蛋白表达阴性，阳性表达有6例。mTOR与 P70S6K 表达呈正相关(r=0.478，P=0.002)。

3 讨论

肾癌在泌尿系肿瘤中较常见，仅次于膀胱癌。肾癌的病因未明，已明确与肾癌发病相关因素有遗传、吸烟、肥胖、高血压及抗高血压治疗等。TOR是近年来发现的一类进化上保守的蛋白家族，在哺乳动物中只发现一种TOR蛋白，即mTOR［6］，其相对分子质量为289 kD，含有2 549个氨基酸残基，对细胞的分化、凋亡起重要作用［1，2］。mTOR信号传导通路活化可抑制多种刺激诱发的细胞凋亡，促进细胞周期进展，从而促进细胞的生存和增殖，同时参与血管生成，在肿瘤形成中扮演重要角色，参与肿瘤的侵袭和转移［8］。在体内，mTOR通过磷酸化多种底物蛋白实现其生理作用。P70S6K是其重要的底物之一［9］。

本实验结果显示，mTOR和P70S6K蛋白在癌旁正常肾组织中均呈低表达，在肾癌组织中均呈高表达，mTOR和P70S6K蛋白的表达随肾细胞癌分化程度的降低而升高，同一标本中mTOR和P70S6K蛋白的表达有显著的相关性。本实验还观察了mTOR和P70S6K蛋白在肾癌组织中的表达与临床病理参数的关系，发现mTOR、P70S6K蛋白阳性表达与肾癌的组织分化程度、淋巴结转移和临床分期有关，与患者性别、年龄无关。我们认为在肾癌中存在异常活化的mTOR信号通路，而且mTOR的表达水平越高，mTOR下游的重要靶点P70S6K表达水平亦越高，从而使细胞中蛋白合成越快，细胞生长越快，进一步加速了细胞的恶化，mTOR和P70S6K蛋白的相互作用促进了肿瘤的发生。

综上可见，mTOR和P70S6K蛋白表达与肾癌的发生、发展有密切关系，可能作为肾癌的一个特异性治疗靶点。

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