醛糖还原酶基因多态性与2型糖尿病视网膜病变的关系

任 珉，赵莉莉，张 莹，师 莹，毛用敏，齐秀英

(1天津市心血管病研究所，天津300222;2天津市胸科医院;3天津医科大学公共卫生学院)

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是糖尿病患者视力受损和致盲的重要原因［1～4］。除高血糖和环境因素影响之外，遗传因素在视网膜病变的发生发展中也起重要作用。醛糖还原酶(AR)是葡萄糖代谢多元醇通路上的限速酶，该酶基因表达异常与DR的发生发展密切相关［5］。既往对AR的研究多集中于其5'端的(AC)n核苷酸重复序列的多态性，近年来AR基因上游启动区-106 C/T单核苷酸多态性开始受到关注。为探讨AR基因上游启动区-106 C/T单核苷酸多态性与DR发病的关系，我们于2009年6月～2011年3月进行了如下研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2009年6月～2010年10月收治的2型糖尿病患者374例，均经1997年美国糖尿病协会(ADA)糖尿病诊断标准［6］确诊。其中病例组 161例，男 84例，女 77例，年龄(59.93±10.68)岁，病程7～16年，有DR病史或住院期间眼底镜检查有视网膜病变，排除其他原因引起的视觉损害、视力下降;对照组213例，男114例，女99例，年龄(58.40±12.96)岁，病程2～12年，无 DR 病史且住院期间眼底镜检查未发现视网膜病变，排除其他原因引起的视觉损害、视力下降者。病例组与对照组年龄和性别分布差异无统计学意义(P均＞0.05)。

1.2 DNA的提取与扩增 两组均于入院次日清晨采集空腹静脉血5 mL，加EDTA抗凝，-80℃保存。采用血液DNA快速提取法(TKM法，TaKaRa公司)提取全血DNA，紫外分光光度计下测定OD260/OD280大于1.7，且琼脂糖凝胶电泳显示DNA完整性良好。采用PCR法行DNA扩增。AR基因上游引物序列为5'-CCT TTC TGC CAC GCG GGG CGC GGG-3'，下游引物序列为 5'-CAT GGC TGC TGC GCT CCC AG-3'(由TaKaRa公司合成)。PCR反应体系中各组分的终浓度为 DNA样本0.5 μg，10×PCR Buffer 2.5 μL，Taq DNA 聚合酶 2.5 U，dNTPs 0.25 μmol/L，上下游引物各 0.4 μmol/L，灭菌纯净水补足体积至25 μL。扩增条件:95℃预变5 min，95℃1 min，66 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环35次，72 ℃延伸7 min。于2%琼脂糖凝胶电泳，恒定电压90 V，紫外透射反射仪下观察结果。

1.3 AR基因-106CT多态性检测 取10 μL PCR产物，加限制性内切酶 BfaⅠ(10 U)1.0 μL，10 ×Buffer K 2.0 μL，双蒸水(ddH2O)7.0 μL，组成 20 μL的反应体系。置于37℃恒温水浴箱中反应6 h。酶切反应结束后，取10 μL酶切产物与2 μL上样缓冲液混合均匀，置于3.5%琼脂糖凝胶，在恒定电压90 V、紫外透射反射仪下观察结果。计算AR基因-106 bp C/T等位基因频率，等位基因频率=(2×纯合子数+杂合子数)/(2×受检者例数)。分析AR基因-106 C/T多态性与DR的关系。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，组间比较用t检验。计数资料用率或构成比表示，组间比较采用χ2检验。采用单因素Logistic回归分析对DR发病的危险因素进行分析，计算OR及其95%CI，并对可能的混杂因素进行调整。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AR基因-106 C/T多态性 AR基因PCR扩增产物为263 bp，其中含有一个非特异性BfaⅠ酶切位点，经酶切后产生206、57 bp的两个片段。AR基因启动子区域-106 bp C/T为SNP基因多态位点(在206 bp片段中)。当此位点为C时PCR产物不存在BfaⅠ酶切位点，电泳显示为206 bp的条带，此为CC型(野生型);为T时产生BfaⅠ酶切位点，206 bp DNA片段被切成147、59 bp的两条片段，此为TT型(变异型);出现206、147、59 bp三个片段，此为杂合子。见图1。病例组中，AR基因型频率CC型为53.42%，CT 型为35.40%，TT 型为11.18%;对照组分别为 39.91%、47.88%、12.21%。病例组 CT/TT基因型频率低于对照组(χ2=7.104，P=0.029)。病例组等位基因C频率为71.12%，T为 28.88%;对照组分别为63.85%、36.15%。病例组T等位基因频率低于对照组 (χ2=4.380，P=0.036)，见表1。

图1 AR基因PCR限制性酶切产物电泳结果

2.2 AR基因Hardy-Weinberg遗传平衡性检验对照组中CC、CT、TT基因型分布频率与期望频率差异无统计学意义(P均＞0.05)，符合Hardy-Weinberg定律，说明达到遗传平衡，具有群体代表性。详见表2。

表1 病例组与对照组AR基因型和等位基因分布［例(%)］

表2 AR基因型频率的Hardy-Weinberg遗传平衡性检验

2.3 AR基因-106 C/T多态性与DR的关系 单因素Logistic回归分析结果显示，-106C/T的CT/TT基因型与 DR 发病有关(OR=0.579，95%CI:0.383～0.876)，且经糖尿病家族史调整后二者间的统计学关联仍然存在。携带T等位基因的2型糖尿病患者发生 DR 的危险性降低(OR=0.717，95%CI:0.525～0.980)。见表3。

表3 AR基因-106C/T多态性与AR的关系

3 讨论

AR基因位于人类染色体7q35，全长约18 kb，含有10个外显子和9个内含子，存在多个多态性位点。已有研究证明，葡萄糖代谢多元醇通路与糖尿病微血管并发症的发生发展有关［7］。AR作为还原型辅酶Ⅱ依赖型醛酮还原酶家族的单体酶，是多元醇通路中的限速酶，对葡萄糖的亲和力较低。在正常血糖浓度下，该酶活性不高，葡萄糖进入细胞后很快被分解，进入三羧酸循环，氧化供能。在高血糖状态下，AR活性增高将导致大量葡萄糖转化为山梨醇，由于山梨醇极性很强，难以透过细胞膜，而在细胞内堆积，并引起还原型辅酶Ⅱ、肌醇和Na+-K+-ATP酶活性降低，干扰细胞代谢，破坏组织结构，影响血管通透性，使毛细血管基底膜增厚，导致视网膜微动脉和毛细血管结构改变(如周细胞变性、基底膜增厚和内皮细胞增生等)，最终导致 DR 的发生［8，9］。

近年来，AR基因启动子-106 C/T多态性与DR的关系逐渐受到学者们的关注。澳大利亚学者［10］率先发现AR基因上游启动区-106 C/T碱基突变，携带C等位基因的糖尿病患者发生DR的危险性增加。有学者［11～15］分别对中国北方汉族、美国、巴西及日本的2型糖尿病患者进行研究，均发现-106C/T的CC基因型与DR的易感性有关。但也有研究［6，16］报道未发现AR基因-106 C/T的多态性与DR的发生有关。本研究结果显示，携带CC基因型和C等位基因的糖尿病患者发生DR的危险性高于CT/TT基因型和T等位基因携带者，经DM家族史调整后这种关联仍然存在，提示AR基因-106C/T的这两种基因型与DR发病有关。AR基因-106C/T的多态性可能会引起AR表达增加，导致多元醇代谢通路激活，使大量山梨醇在细胞内蓄积，形成细胞内高渗状态，大量细胞外液渗入，导致细胞水肿。同时，山梨醇改变了细胞膜的通透性，使K+、肌醇等大量丢失，引起组织结构和功能异常，最终导致DR的发生。由于不同研究人群、样本量不同等原因的影响，本研究结论与相关研究尚存在一定差异，关于AR基因-106 C/T多态性与DR的关联性，还有待进一步深入研究。

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