正常妊娠中期羊水细胞因子水平分析

刘乐南，冯振华，李 洁，戴毅敏，朱海燕，许碧云，周乙华，胡娅莉

0 引 言

胎儿是一个半抗原移植物，成功的妊娠要求母体免疫系统对其充分耐受，而最复杂、也是首当其冲的免疫反应发生在母胎界面［1］。近年研究表明，很多重要妊娠并发症如早产、子痫前期等都与母胎界面局部的炎症免疫过度激活有关［2-4］。由于人类妊娠过程中很难获得标本以研究母胎界面局部炎症免疫状况，而羊水中炎症相关的细胞因子浓度则可能成为反映母胎界面炎症免疫状态的窗口。为了解正常妊娠时羊水中炎性细胞因子的情况，为今后病理妊娠的研究提供参照，本研究利用高灵敏度MILLIPLEX MAP试剂及Luminex仪器对妊娠结局正常的中孕期羊水进行了主要炎性细胞因子的检测。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2009年4月至2012年3月323例因中孕期母血清唐氏综合征筛查高风险、孕妇高龄等原因在我院行羊膜腔穿刺的孕妇为研究对象，羊水采集孕周为18～22+6周，随访妊娠经过、分娩孕周及有无胎膜早破、有无绒毛膜羊膜炎、新生儿性别、出生体重、新生儿是否有肺炎及败血症等内容，将胎儿染色体异常、胎儿结构异常、早产、多胎妊娠、有妊娠并发症、有明显宫内感染迹象以及穿刺前7 d内用过抗生素者排除。本研究获得南京医科大学鼓楼临床学院伦理委员会批准，并获得孕妇知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集及处理 在B超引导下经腹羊膜腔穿刺采集羊水27 mL，其中最初2 mL弃去，20 mL用于胎儿染色体检查，余5 mL用于本实验。样本离心(13000r/min、4℃、10min、离心半径6cm)分离上清和沉淀，分别保存于-30℃。

1.2.2 细胞因子检测方法 采用MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel(美国Merck公司)，按试剂盒说明制备10000 pg/mL标准品、高浓度和低浓度质控品及5种细胞因子混合磁珠，并将标准品以5倍稀释以制定标准曲线，储存标本于室温融化并混匀，离心(13000 r/min、4℃、10 min、离心半径6 cm)后取上清待测，将25 μL标准品、质控品及待测标本分别与25 μL预混磁珠和25 μL缓冲液混合，并置于4℃震荡过夜。次日将反应体系置于磁板上，清洗反应体系后，先加入25 μL检测抗体于室温震荡反应1 h，再加入25 μL显色剂于室温震荡反应30 min，再次将反应体系置于磁板上，清洗反应体系后加入150 μL鞘液并使用Luminex公司液相芯片分析系统进行细胞因子的定量分析。每个样本均采用复孔，结果取平均值。本研究IL-10、IL-1β、IL-6、MCP-1 和 TNF-α 的灵敏度分别为0.61、0.05、0.14、0.54 和 0.25 pg/mL。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件分析处理数据。孕妇年龄、新生儿体重、取样和分娩孕周均采用均数±标准差(±s)表示。对各种细胞因子水平的分布进行W检验，根据其非正态分布特征，各细胞因子浓度均采用中位数(M)、最小值(Min)和最大值(Max)描述，以Mann-Whitney检验不同胎儿性别间五种细胞因子水平比较，以Kruskall-Wallis检验对不同孕周和孕妇年龄间五种细胞因子水平比较。采用P 2.5～P 97.5确定细胞因子参考范围。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

323例孕妇中6例胎儿染色体异常、13例早产、41例出现妊娠期高血压疾病、妊娠期糖尿病等妊娠并发症，故排除上述60例孕妇，其余妊娠结局正常的263名孕妇为最终研究对象。孕妇平均年龄(30.15±5.68)岁，平均取样和分娩孕周分别为(20.3±1.1)周和(39.7 ±1.0)周。263 例孕妇中106名经阴道分娩，余157名因胎位不正、头盆不称等原因行剖宫产。新生儿平均出生体重为(3.5±0.4)kg，男婴135 名、女婴128 名。

2.1 中孕期羊水 IL-10、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α水平以及性别的影响 263例中孕期羊水细胞因子水平结果见表1。孕女性胎儿孕妇中孕期羊水IL-10和IL-1β低于孕男性胎儿孕妇，差异有统计学意义(P ＜0.05)。2 组间 IL-6、MCP-1 和TNF-α差异无统计学意义(P ＞0.05)。

2.2 中孕期不同孕周对羊水 IL-10、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α水平的影响 妊娠18～22+6周各周羊水中细胞因子的平均水平见表2。5种细胞因子各组间差异无统计学意义(P＞0.05)，IL-6水平虽然随孕周增加而呈增高趋势，但差异无统计学意义(P ＞0.05)。

2.3 孕妇年龄对中孕期羊水 IL-10、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α水平的影响 263名孕妇按组距5岁分组，20～24岁者47名、25～29岁者95名、30～34岁者52名以及69名≥35岁的高龄产妇。不同年龄段孕妇各指标差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表1 中孕期不同性别胎儿孕妇羊水细胞因子比较(pg/mL)Table 1 Fetal gender and cytokines levels in amniotic fluid at mid-trimester(pg/mL)

表2 孕妇不同孕周羊水细胞因子水平［M(Min～Max)，pg/mL］Table 2 Cytokines in amniotic fluid at the 18th-22ndgestational week(M［Min-Max］，pg/mL)

表3 孕妇年龄与细胞因子水平［M(Min～Max)，pg/mL］Table 3 Maternal age and cytokines levels in amniotic fluid at mid-trimester(M［Min-Max］，pg/mL)

3 讨 论

细胞因子是维持机体正常免疫功能的重要成份，反映了机体全身或局部炎症免疫的状态。妊娠后，在母胎界面除母体的免疫细胞外，子宫蜕膜细胞和滋养细胞也能合成相关细胞因子，为胎盘着床、母体免疫耐受形成、维持胎儿宫内生长发育提供必要的条件［5］。有研究表明，中孕期羊水中炎症相关细胞因子增高可能与很多妊娠并发症相关［6-11］，但对于正常妊娠中期羊水中细胞因子水平并不十分了解。

3.1 影响羊水中炎性细胞因子浓度的因素 本研究发现孕男性胎儿孕妇的中孕期羊水中IL-10和IL-1β水平略高于孕女性胎儿孕妇。提示男性胎儿母胎界面局部炎症反应可能比女性胎儿激烈。因本研究的研究对象均为正常妊娠结局者，故尚不能说明上述因子增高有何临床意义。

妊娠过程中羊水成分在不断变化，高龄孕妇相对适龄孕妇发生妊娠并发症的风险也在增加，因此本研究就孕龄及孕妇年龄对细胞因子水平的影响做了研究。结果显示胎儿性别及孕妇年龄、孕龄均不影响IL-6、MCP-1、TNF-α的水平，与既往研究结果一致［12-13］。提示此3种因子在中孕期羊水中的稳定性及作为预测不良妊娠结局指标的独立性。

3.2 与既往研究中孕期羊水 IL-10、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α检测水平的比较 本研究正常孕妇中孕期羊水中5种细胞因子检测水平与其他研究结果差异较大。Perni等［14］使用ELISA检测结果显示IL-1β和IL-6水平分别约是本研究结果的17倍和7倍，但TNF-α水平却较本研究结果低。而本研究结果显示 IL-1β、IL-6和 TNF-α 水平均低于 Chow等［12］使用Bio-Plex细胞因子检测试剂盒检测结果，但Chow等［12］研究结果中IL-1β和IL-6水平仍明显低于Perni等［14］研究结果。即使是同一国家，其检测水平也存在明显差异［14-15］。不同国家地区间正常孕妇中孕期羊水中五种细胞因子检测水平存在较大差异，这可能是因为各研究对象的人种以及检测细胞因子水平的试剂盒等不同引起。因此，在进行相关研究时，各实验室应根据研究对象基本特征及试剂盒的不同，设立相应对照组，确定相应的参考值。

3.3 羊水中细胞因子检测方法 羊水中细胞因子反应了母胎界面的炎症免疫应答，而此类炎性细胞因子并非细菌感染刺激产生，而主要是内源性分子刺激所致，故羊水中炎性细胞因子浓度较低，故羊水中炎性细胞因子的检测需要灵敏度高的检测方法。本研究采用灵敏度较高的Luminex公司液相芯片分析系统及MILLIPLEX MAP细胞因子检测试剂检测羊水细胞因子，其检测原理为含有2种荧光染料的内在颜色编码微磁珠，每个珠子上都包被有特异性的捕获抗体，并通过染料的不同浓度确定不同的磁珠捕获检测样本中的分析物，加入生物素标记的检测抗体后与作为报告分子的显色剂结合，待液相芯片分析系统中两种激光分别激发磁珠内部染料及报告分子上荧光染料，高速数字信号将处理识别每个磁珠，并通过荧光报告信号即可定量生物分析的结果。这种磁珠的微小体积、液体悬浮性、快速动力学以及高面积体积比使得此试剂盒灵敏度高，且仅需50 μL样本就可以同时检测多种细胞因子，从而为珍贵样本检测提供了保障。

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