非小细胞肺癌中缺氧诱导因子-1α和p-糖蛋白的表达及其与人乳头状瘤病毒感染的相关性

周 颖，张 辉，谢永红，赵 敏，沈 彦，尹端端

0 引 言

缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是近年发现的一种转录因子，已有研究发现HIF-1α在肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中过度表达。p-糖蛋白(p-glycoprotein，p-gp)介导的多药耐药(multidrug resistance，MDR)在人类肿瘤中具有普遍性，由MDR/p-gp介导的耐药机制在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中亦占有重要地位。人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一种DNA病毒，感染人和动物的皮肤或黏膜可引起增殖性损伤。近年来，越来越多的国内外临床和实验室研究检测出肺癌患者携带HPV［1-2］，尤其是HPV 16、18型。HPV感染与肺癌的关系，目前说法不一，肺癌中HIF-1α、p-gp与HPV感染的关系亦报道较少。本研究通过研究NSCLC中HIF-1α和p-gp的相关性，探讨HIF-1α和p-gp在NSCLC发生发展及MDR中的作用，并初步分析其与HPV感染的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集我院2012年1-5月NSCLC患者的手术标本60份作为NSCLC组，患者中男46例，女14例;鳞癌42例，腺癌18例;高分化12例，中分化29例，低分化19例;淋巴结转移30例，无淋巴结转移30例;有吸烟史43例，无吸烟史17例。另以20份肺良性病变组织作为对照，其中包括肺结核6份，炎性假瘤5份，硬化性血管瘤4份，肺大疱4份，支气管扩张1份。标本取材后，部分置-20℃保存，部分中性甲醛固定，石蜡包埋。

1.2 HPV PCR 检测

1.2.1 引物 选用分别用来扩增HPV16、18型的特异性引物2对。HPV16E6正义链:5'-CTGCAAGCAACAGTTACTGCGACG-3'，反义链:5'-CATACATCGACCGGTCCACC-3'，长度 315 bp;HPV18E7 正义链:5'-GAGCCGAACCACAACGTCAC-3'，反义链:5'-GGATGCACACCACGGACACA-3'，长度152bp。引物均由北京奥科生物公司合成。

1.2.2 组织DNA的提取 取适量冻存组织，加提取缓冲液制成单细胞悬液后，沸水浴10 min，冷却至室温加蛋白酶K消化，酚-氯仿-异戊醇反复抽提3次，再经100%冰冷无水乙醇沉淀、70%冰冷无水乙醇洗涤后，加 TE(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，PH 8.0)缓冲液溶解所得DNA并4℃保存。

1.2.3 PCR扩增反应 PCR反应体系:每25 μL反应体系中包含 10 × buffer 2.5 μL，20 pmol/μL 引物各 0.5 μL，Taq 酶 1 μL(1 U/μL)，Mg2+1.5 μL，dNTPs 0.5μL，去离子水16.5μL 及DNA 模板2μL。扩增条件:94℃预变性5min，循环特征为94℃ 45s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共30 个循环，72℃延伸8 min。每次实验以不加模板为阴性对照，HPV16、18型分别用Siha和Hela细胞株DNA作阳性对照。PCR扩增产物用加有溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶，80 V电压下电泳约40 min，于紫外透射仪上观察结果。

1.3 免疫组化检测HIF-1α、p-gp的表达

1.3.1 试剂与方法 HIF-1α 抗体、p-gp抗体及通用型SP试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司，染色步骤严格按试剂盒说明书操作。一抗稀释浓度为1∶100。阴性对照用PBS代替一抗。

1.3.2 判断标准 HIF-1α阳性表达为细胞核出现棕黄或棕褐色颗粒，p-gp阳性表达为细胞膜或细胞质出现棕黄或棕褐色颗粒，显色结果由2位病理医师采用半定量评分系统独立判定。每例均高倍镜下(×400)随机选择5个视野，每个视野计数200个细胞，取平均值，用半定量积分法判断结果:0分阴性;1分＜25%;2分25% ～75%;3分＞75%。阳性强度:1分弱表达(浅黄色);2分中等强度表达(棕黄色);3分强表达(棕褐色)。两者积分相乘，0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(±)，4～6分为中等阳性(+)，7～9分为强阳性(2+)。

1.4 统计学分析 用SPSS 12.0软件进行统计分析，率的比较用χ2检验及确切概率法，参数间的相关性采用Spearman等级相关分析，以P≤0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 HIF-1α、p-gp的检测结果及两者的相关性NSCLC组中HIF-1α的阳性表达位于细胞核，阳性率为48.3%(29/60)，肺良性病变未见阳性表达(χ2=15.163，P ＜0.05)。p-gp 的阳性表达位于细胞膜或细胞质，阳性率为60.0%(36/60)，肺良性病变组未见阳性表达(χ2=21.818，P ＜0.05)。HIF-1α阳性者中p-gp的表达率明显高于HIF-1α阴性者，两者呈正相关(r=0.313，P ＜0.05)。见表1。

表1 NSCLC组织中HIF-1α与p-gp表达的关系［n(%)］Table 1 Relationship between HIF-1α and p-gp expression in NSCLC n(%)

2.2 HIF-1α、p-gp表达与临床病理特征的关系NSCLC组HIF-1α表达与性别、年龄、吸烟、组织学分型无关，与组织分化程度及淋巴结转移相关，高分化型HIF-1α表达率低于中、低分化型，两者差异有统计学意义(P＜0.05);淋巴结转移者HIF-1α表达率高于无转移者，两者差异有统计学意义(P＜0.05)。NSCLC组p-gp表达与性别、年龄、吸烟、组织分化程度、淋巴结转移无关，与组织学分型相关，肺腺癌表达率高于肺鳞癌，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 NSCLC组织中HIF-1α、p-gp表达、HPV感染与临床病理特征的关系［n(%)］Table 2 Relationship between HIF-1α，p-gpexpression，HPV infection and clinicopathological data in NSCLC n(%)

2.3HPV DNA的PCR检测结果及与临床病理特征的关系 NSCLC组 HPV DNA检出率为41.7%(25/60)，肺良性病变组5.0%(1/20)，差异有统计学意义(χ2=9.193，P ＜0.05);HPV16、18 型特异性引物分型检测，HPV16 型12例，检出率为48.0%(12/25)，18 型13例，检出率为52.0%(13/25)。NSCLC组 HPV感染与性别、年龄、吸烟、组织学分型无关，与组织分化程度及淋巴结转移相关。高分化型HPV DNA检出率低于中、低分化型，差异有统计学意义(P＜0.05);淋巴结转移者HPV DNA检出率高于无淋巴结转移者，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图1。

图1 PCR检测HPV16、18型DNA扩增结果电泳图Figure 1 Electrophoresis of HPV16/18 DNA detected by PCR

2.4 HIF-1α、p-gp的表达与 HPV感染的关系HPV DNA阳性者与阴性者间HIF-1α的阳性表达率分别为52.0%和45.7%，差异无统计学意义(P＞0.05)。HPV DNA阳性者与阴性者间p-gp的阳性表达率分别为64.0%和57.1%，差异无统计学意义(P ＞0.05)。

3 讨 论

HIF-1是由α、β亚单位构成的异二聚体，其中HIF-1α受缺氧的调节［3］。缺氧是实体肿瘤微环境特征之一。在细胞缺氧时，细胞核中HIF-1α显著增加。HIF-1α不仅调节众多的下游基因以维持或促进肿瘤的血管形成和肿瘤的发展，而且可反馈接受肿瘤生长过程中产生的因子或缺氧环境上调表达，如此形成恶性循环促进肿瘤生长、浸润和转移［4］。本研究中，HIF-1α在 NSCLC组中阳性表达率48.3%，肺良性病变组未见阳性表达，提示HIF-1α参与了NSCLC的发生发展过程。本研究结果还显示，HIF-1α的表达与组织分化程度、淋巴结转移有关，与 Swinson等［5］的结果基本一致。高分化型HIF-1α的表达率低于中、低分化型，推测肿瘤分化程度降低，缺氧程度明显加重，HIF-1α表达上调，通过与缺氧反应元件作用便利于肿瘤克服缺氧并诱导新生血管形成，浸润生长。淋巴结转移者HIF-1α的表达率高于无淋巴结转移者，其机制可能为HIF-1α通过调节其下游基因VEGF诱导肿瘤新生淋巴管形成，同时上调COX-2，促使癌细胞对基质的黏附性增加，E-cadherin蛋白水平下降，使癌细胞易于转移［6］，提示HIF-1α是NSCLC发生发展中的关键步骤，并参与肿瘤的侵袭和转移。

p-gp是最早发现和克隆的耐药蛋白，目前认为p-gp是一种药物排出泵，将进入细胞的化疗药物排出，导致细胞内化疗药物浓度降低而引起耐药［7］。p-gp介导的MDR在人类肿瘤中具有普遍性［8］。本研究中，p-gp在NSCLC组中的阳性表达率60.0%，肺良性病变组未见阳性表达，且肺腺癌p-gp的表达率高于肺鳞癌，符合临床上鳞癌比腺癌对化疗药物敏感的现象［9］。MDR1/p-gp是HIF-1α的一个靶基因，在MDR1/p-gp启动子上存在HIF-1α的结合位点，HIF-1α可诱导MDR1/p-gp的表达增加，肿瘤耐药性增强。Comerford等［10］研究表明 HIF-1α可调控MDR1/p-gp，诱导其表达上调，且进一步用反义寡核苷酸阻断HIF-1α表达可导致MDR1 mRNA和p-gp表达下调。Waternberg等［11］在体外研究中也发现低氧微环境可上调p-gp表达，并需要HIF-1α参与［12］。本研究发现NSCLC中HIF-1α阳性者p-gp的表达率高于阴性者，两者呈正相关，提示HIF-1α可能通过上调p-gp的表达参与NSCLC的发生发展，并共同影响肿瘤耐药。

HPV感染是宫颈癌的主要病因，然而近年来HPV感染与肺癌的关系已经引起人们的重视［13］。本研究证实NSCLC组HPV DNA检出率与肺良性病变组差异有统计学意义，提示 HPV感染可能是NSCLC发生的病因学因素之一。HPV感染与NSCLC患者临床病理资料的关系目前尚未明确，本研究发现HPV感染与性别、年龄、吸烟、组织学分型无关，与组织分化程度、淋巴结转移相关。高分化型NSCLC HPV DNA的检出率低于中、低分化型，可能是由于分化成熟的细胞退出了细胞周期，细胞不再具有分裂能力，细胞内仅有少量病毒复制所需的复制酶。淋巴结转移组HPV DNA的检出率高于无淋巴结转移组。Lane等［14］报道HPV阳性的肿瘤细胞株与HPV阴性的相比VEGF的表达水平普遍升高。Lopez-ocejo等［15］认为 HPV E6可能如一些原癌基因一样能够使VEGF表达增强。VEGF不仅诱导血管生成，还可诱导肿瘤外周形成新的淋巴管，促进癌细胞通过淋巴管转移到淋巴结。由此推测HPV感染与淋巴结转移可能存在一定的相关性。

HIF-1α与HPV感染之间的关系国内外研究较少，其可能的联系有:野生型P53蛋白可通过直接抑制HIF-1α转录活性和通过促进 mdm2介导的HIF-1α泛素化-蛋白酶降解2种形式抑制HIF-1α活性。而 Munger［16］报道 HPV16、18 型 E6 可以降解野生型P53蛋白。HPV DNA阳性者HIF-1α的表达率稍高于阴性者，但差异无统计学意义，可能由于HPV通过P53对HIF-1α的影响是有限的，两者的关系有待今后进一步的深入研究。HPV DNA阳性组与阴性组间p-gp的表达率差异无统计学意义，提示HPV感染与p-gp表达之间并无直接联系，但也可能由于实验的局限性影响到实验的结果;另外也不排除HPV感染与p-gp表达之间可能通过多因素、多途径相互作用，两者相互关系及可能的内部机制有待今后深入探讨。

综上所述，HIF-1α与p-gp参与NSCLC的发生发展及MDR。共同检测NSCLC中HIF-1α与p-gp的表达对预测化疗是否耐药、评估患者预后有一定的参考价值。HIF-1α有望成为肿瘤治疗的新靶点，通过阻断HIF-1α从而降低肿瘤的MDR可达到治疗肿瘤，提高患者生存率的目的。

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