壮骨止痛方全方提取物对去势雌鼠骨保护素的影响＊

张国民，黄 娟，宁炯杰，李筠芝，莫新民，刘慧萍

(湖南中医药大学，长沙 410208)

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量减少、骨组织微细结构破坏为特征，继而导致骨脆性增加和骨折危险性增高的1种全身性骨骼疾病。我国原发性骨质疏松症的发病率男性为60.72%，女性现已高达90.48%［1］。如何积极预防老年人特别是绝经后妇女骨质疏松症，提高人民生命质量，已成为当前亟待解决的课题。壮骨止痛方由补骨脂、淫羊藿、枸杞、牛膝等7味药物组成，具有补肾气、温肾阳、兼顾滋补肝肾阴精、壮骨止痛的功效［2］。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只3月龄雌性SD大鼠，体质量250 g左右，由广东省医学实验动物中心提供(合格证号SCXK(粤)2008-0002)。

1.2 药品及试剂

壮骨止痛方全方提取物由中南大学药理学实验室提供;E2放免试剂盒(批号HY-032)，北京华英生物技术研究所;一抗:OPG(批号BA1475)、SABC试剂盒(批号 SA1022)、DAB显色试剂盒(批号AR1022)，均购自武汉博士德生物有限公司。

1.3 主要仪器

r放射免疫计数器(GC-1500)、JY3002型电子天平、超低温温冰箱、LEICA DM LB2型双目显微镜、HHS-2电子恒温不锈钢水浴锅、Haier医用微波炉、LKB-Ⅲ型超薄切片机、JEOL-1230型透射电镜、MIAS医学图像分析系统、Motic B5显微摄像系统等。

2 方法

2.1 造模方法

适应性饲养1周，随机分出空白组和假手术组各15只，除空白组外，其余均用2%戊巴比妥钠(0.2 mL/100 g体质量)麻醉，在无菌条件下从距离大鼠第一胸腰椎外侧1 cm处纵向切开皮肤及两侧肌肉，摘除双侧卵巢，假手术组仅在卵巢周围切除相应重量的脂肪，分两层缝合伤口并用生理盐水擦洗干净血迹，术后连续3 d大腿肌肉注射青霉素，每只大鼠4万 u/d，饲养于室温 23～25℃、相对湿度50% ～70%的清洁环境中，自由摄食和摄水［3］。

2.2 动物分组

术后1周将模型大鼠随机分为模型组、壮骨止痛方全方组，加上假手术组和空白组共4组，每组15只。

2.3 给药方法

术后1周开始给药，各组给药剂量均严格按照临床给药剂量进行人鼠体表面积换算后，根据各药的临床给药剂量的提取量进行确定，并且根据实际情况把药物制备成油相和水相。给药剂量为:油相0.4 mL/100 g体质量，水相0.6 mL/100 g体质量，为消除差异，水相加灌油中王牌的植物油，油相加灌冷的白开水，即各组油和水的每次给药总剂量为1 mL/100 g体质量。模型组、空白组、假手术组只灌胃相应体积的植物油和冷开水。连续灌胃13周，每10 d称1次体质量，13周之后按文献要求处死动物，并取材检测相关指标［2］。

2.4 检测指标

连续灌胃13周，每10 d称1次体质量，13周之后所有大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.4 mL/100 g)麻醉后，腹部切口分离腹主动脉，用负压采血管采血10 mL，离心后分离血清检测雌二醇;取右侧胫骨用5%的硝酸脱钙1周，2.5%戊二醛固定24 h以上，超薄切片厚约500埃，电子染色，观察骨组织的超微结构;取左侧股骨，用4%的多聚甲醛固定48 h，然后用5%的硝酸脱钙1周，石蜡包埋，用Shandon切片机间断连续切片，切片厚4 um，采用SABC法检测OPG在骨组织中的表达，染成棕黄色为阳性表达。每张免疫组化的切片选5个视野，参与计算机图像分析。采用北航MIAS医学图像分析系统，在40倍物镜下行阳性面积计数，平均面密度测定。

2.5 统计学方法

采用SPSS 15.0统计软件进行分析，所有数据均以均数±标准差(±s)表示，组间比较方差齐时用方差分析，方差不齐时用轶和检验。

3 结果与分析

3.1 对去势雌性骨质疏松症大鼠血清E2影响

表1 各组对雌鼠血清E2的影响(±s)

注:与模型组比较:▲P＜0.05;▲▲P＜0.01

组别 例数 E2(pg/ml)15 2.82±0.10全 方 提 取 组 15 5.81±1.12▲空 白 对 照 组 15 4.00±0.36▲假 手 术 组 15 4.03±0.30模型组▲▲

与模型组比较，各组都能明显升高大鼠血清E2含量(P＜0.05)。

3.2 对去势骨质疏松症模型雌鼠右胫骨骨细胞超微结构的影响

图1～5显示，模型组大部分骨细胞胞核及胞浆浓缩明显，骨细胞突起明显减少，骨陷窝椭圆形;壮骨止痛方组骨细胞较正常，骨细胞突起无明显改变，骨陷窝明显缩小呈扁椭圆形;假手术组骨间质致密，骨细胞内部分线粒体存在空泡变性，骨陷窝较小;空白组骨细胞线粒体无变性，骨细胞突起无改变，骨陷窝较小。

3.3 OPG的表达

表2显示，采用免疫组织化学检测OPG。结果判断，阳性细胞的细胞膜和胞浆被染成棕黄色(见图6～10)，与阴性细胞形成鲜明对比。切片于光镜下400倍放大，经显微摄像系统随机摄取5个视野，通过图像分析系统检测每个视野内阳性染色细胞面密度并取其平均值。所得数据用方差分析进行统计处理。

表2 各组大鼠股骨组织OPG表达的平均面密度表达比较(±s)

表2 各组大鼠股骨组织OPG表达的平均面密度表达比较(±s)

注:与模型组比较:★P＜0.01

组别 例数OPG模 型 组15 10.32±1.01全 方 提 取 组 15 19.82±1.98★空 白 对 照 组 15 17.24±2.11★假 手 术 组 15 17.59±2.16★

与模型组比较，壮骨止痛方组能够显著增加大鼠OPG的平均面密度(P＜0.05)。

图6 ～10 OPG免疫组化染色

4 讨论

骨组织是雌激素的靶器官之一，这一观点正由日渐增多的研究所证实，雌激素对于维护骨吸收及骨形成的平衡至关重要［4］。实验证明，补肾中药能够增加成骨细胞上雌激素受体(ER)，具有雌激素样作用，针对肾虚实质使下丘脑-垂体-性腺之间保持动态平衡，这也是补肾中药治疗骨质疏松症的可能机制之一。壮骨止痛方组方中补骨脂、枸杞等药物都具有雌激素样作用［5］。正常情况下，破骨细胞形成刺激因子OPGL及抑制因子OPG的表达是平衡的，破骨细胞的分化发育和激活受到巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、骨保护蛋白 (OPG)和骨保护蛋白配体(OPGL)3种信号分子的调节［6］，使骨形成和骨吸收维持平衡状态。因而，OPG和OPGL构成了直接影响破骨细胞分化及其功能、调节骨再建的细胞调控网络，也是其他许多细胞因子介导破骨细胞和骨吸收的最终和共有通路。现有研究表明，OPG基因敲除的小鼠表现严重骨质疏松，转OPG基因小鼠可引起骨骼弥漫性硬化［7］，表明OPG对骨密度具有重要调节作用。本实验模型组OPG较空白对照组下降，差异有统计学意义。

通过本实验研究发现，壮骨止痛方全方提取物能改善去势骨质疏松模型大鼠机体激素代谢紊乱，增加雌二醇含量，提高OPG含量而起到抗骨质疏松的作用;可显著增加去势雌鼠左股骨骨小梁密度和左股骨颈梁髓比，改善胫骨骨组织超微结构，从而改善骨基质的分子结构，加强骨生物力学性能。

［1］朱建民，程秦娣.绝经后骨质疏松症［J］.中华内分泌代谢杂志，2006，12(4):234-236.

［2］张国民，莫新民.壮骨止痛方全方提取物对去势雌鼠基质金属蛋白酶2的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2010，16(11):1010-1012.

［3］朱蕾，赵小英，卢兴国.去卵巢大鼠骨密度变化与骨髓组织血管生成的关系［J］.中国病理生理杂志，2009，25(9):1801-1805.

［4］Tmuer，C.H.，Sato，M.，nadByrnad，H.U.Raloxiefne Presevres bone srength and bone mass in ovariectiomized rats［J］.Endocrinology，1994a，135:2001-2005.

［5］曾英，莫新民，雷晓明，等.壮骨止痛胶囊对去卵巢雌鼠骨质疏松症骨强度和生物力学的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2007，13(4):292-295.

［6］Turner RT，Wakley GK，Hannon KS，et al.Tamoxifen inhibits osteoclast mediated resorption of trabecular bone in ovarian hormone delicient rats［J］.Endocrinology，1988，112:1146.

［7］Wronski TJ，Cintron M，Doherty AL，et al:Estrogen treatment prevents osteopenia and depresses bone turnover in ovariectomied rats［J］.Endoerinology，1988，123:618.