三七、栀子组分配伍对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞氧化应激反应的影响＊

郭晓谨，李兴广△，李卫红△，胡京红，周梦佳，盖 聪，李芳赫，臧妍妍，万亮琴，于慧芳

(1.北京中医药大学，北京 100029;2.通州中西医结合医院，北京 101100)

通络救脑注射液(Tong luo jiu nao injection，TLJN)是针对缺血性脑卒中“毒损脑络”病机［1］研发的现代注射剂，在缺血性脑损伤中发挥了良好的脑保护作用。体外实验也发现，该注射液能够有效提高拟缺血损伤大鼠脑微血管内皮细胞的活性［2］，然而注射液中的2个有效组分栀子苷、三七总皂苷在血管保护中的内在机制与组方特点，目前尚不明确。前期的研究显示，2个组分在发挥疗效的时间以及作用机制上有所不同［3］。本实验在前期研究的基础上，从氧化损伤方面观察TLJN、栀子苷、三七总皂苷各自的药效特征，以期为该中药复方组分配伍的科学内涵提供实验依据。

1 方法

1.1 大鼠脑微血管内皮细胞

采用实验室已建立的方法［4］，进行内皮细胞原代取材、分离纯化和培养。

1.2 拟缺血损伤模型的制备

采用本实验室已建立的氧糖剥夺模型［5］，细胞传至第三代，用无糖的Kreb’s液置换原培养基，放入低氧培养箱(气体含量为94%N2、5%CO2、1%O2)，37℃继续培养 6 h。

1.3 实验分组与处理

培养的脑微血管内皮细胞分成5组，分别为正常组、模型组、栀子苷组、三七总皂苷组、通络救脑注射液组。除正常组外，其余各组按上述方法造模。各给药组分别按栀子苷22 μg/ml、三七总皂苷22 μg/ml、通络救脑注射液44 μg/ml的药物浓度在造模前3 h及造模过程中给药，处理结束后进行下列指标检测。

1.4 CCK-8法检测细胞活性

造模完成后每孔加入10 μl CCK-8溶液，在培养箱中继续孵育2 h后，用酶标仪测定各组的吸光光度值，检测波长为450 nm，每组设6个复孔。

1.5 生化法检测MDA和SOD含量

各组细胞在干预因素作用后，用 D-Hank＇s液洗2次后，用细胞刮收集培养皿中细胞，在冰上用细胞破碎机破碎细胞，4℃、117.6N离心20 min后取上清，BCA法检测蛋白定量。MDA含量检测，上样量为100 μl，操作步骤按测定试剂盒说明进行，在532 nm处，用酶标仪检测各组吸光度值(OD值)。SOD活性检测方法，上样量为20 μl，操作步骤按测定试剂盒说明进行，在450 nm处用酶标仪检测各组吸光度值(OD值)。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，数据均以均数±标准差(±s)表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物对拟缺血损伤内皮细胞活性的影响

表1显示，与正常组比较，模型组OD值显著降低(P＜0.01);与模型组比较，3个给药组的OD值均有不同程度升高，通络救脑注射液的作用均优于2个组分(P ＜0.05)。

表1 各组药物对拟缺血损伤内皮细胞活性的影响(n=6，±s)

表1 各组药物对拟缺血损伤内皮细胞活性的影响(n=6，±s)

注:与正常对照组比较:＊＊ P＜0.01;与模型组比较:#P＜0.05，##P＜0.01;与栀子苷比较:△P ＜0.05，与三七总皂苷比较:□□P ＜0.01

组别 内皮细胞活性(OD值)正常组2.638 ±0.138模型组2.012 ±0.147＊＊栀 子 苷 组 2.302 ±0.202#三 七 总 皂 苷 组 2.210 ±0.140#通 络 救 脑 注 射 液 组 2.540 ±0.174##△□□

2.2 各组药物对拟缺血损伤内皮细胞氧化应激反应的影响

表2显示，与正常组比较，模型组MDA含量明显升高(P ＜0.01)，SOD 活性降低(P ＜0.05)，说明氧糖剥夺模拟缺血损伤激活了内皮细胞的氧化应激反应;与模型组比较，3个给药组的MDA含量均有不同程度下降，其中栀子苷对MDA的降低作用优于三七总皂苷(P＜0.05)，通络救脑注射液优于两组分(P＜0.01);与模型组比较，3个给药组的SOD活性均有不同程度升高，三七总皂苷效果优于栀子苷(P＜0.05)，通络救脑注射液的作用均优于2个组分(P ＜0.01)。

表2 各组药物对拟缺血损伤内皮细胞氧化应激反应的影响(n=3，±s)

表2 各组药物对拟缺血损伤内皮细胞氧化应激反应的影响(n=3，±s)

注:与正常对照组比较:＊＊ P ＜0.01;与模型组比较:#P ＜0.05，##P ＜0.01;与栀子苷比较:△P ＜0.05，△△P ＜0.01;与三七总皂苷比较:□P ＜0.05，□□P ＜0.01

组别 MDA含量(nmol/ml)SOD活性(U/mgprot)正 常 组23.847 ±2.396 40.140 ±0.231模 型 组 51.977 ±3.780＊＊ 20.120 ±0.531＊＊栀 子 苷 组 28.880 ±3.276#□ 25.448 ±0.524#三 七 总 皂 苷 组 38.016 ±2.632## 36.483 ±0.477##△通络救脑注射液组 27.550±6.127#△□□ 37.426±0.708##△△□□

3 讨论

通络救脑注射液由栀子、三七配伍而成。栀子性寒味苦，具有凉血解毒之功;三七味甘性温，具有和营止血、通脉行瘀之效，两药配伍共奏解毒、化瘀、通络之效。前期的药效学研究显示，通络救脑注射液对大鼠脑梗死具有良好的治疗效果，明显增加局部脑血流量，改善脑梗死所致大鼠的偏瘫体征，减轻脑水肿和神经细胞的继发性损害，改善缺血区微循环，改善神经功能缺损［6］。本实验在前期研究的基础上，从氧化损伤方面观察了TLJN、栀子苷、三七总皂苷各自的药效学特征。从CCK-8检测结果可以看出，通络救脑注射液、栀子苷、三七总皂苷均能提高受损内皮细胞的活性，对拟缺血内皮细胞具有保护作用，其中通络救脑注射液的作用显著优于2个组分(P＜0.05)，体现了由两有效组分配伍而成复方的疗效优势。

脑缺血后，脑组织内生成大量氧自由基(Oxygen free radical，OFR)，OFR的主要作用是引起细胞膜脂质发生过氧化反应。由于脑组织中富含脂质，因此脑对OFR损害尤为敏感，从而导致脑细胞膜损害，细胞代谢障碍，最终导致细胞凋亡［7］。MDA是氧自由基与生物膜多聚不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的产物，产生量与氧自由基的量相平行，因而测定MDA最可反映氧自由基的水平，间接反映出细胞损伤的程度。SOD是体内非常重要的氧自由基清除酶，可通过歧化方式清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，测定SOD可反映机体内源性抗氧化能力。本实验结果显示，脑微血管内皮细胞氧糖剥夺后MDA含量显著增加，SOD活性下降，表明在脑缺血时，细胞的氧化应激损伤增强。栀子苷可有效降低受损细胞MDA含量，该作用比三七总皂苷显著，而三七总皂苷在提高SOD活性方面优于栀子苷，提示两组分都具有抗氧化损伤作用，但发挥疗效的环节有所不同，栀子苷在抑制自由基的脂质过氧化反应方面作用突出，这可能与栀子“凉血解毒”的功效有关;而三七总皂苷的抗氧化作用主要通过增强自身氧自由基清除的途径实现的，这可能是中药三七“补虚、通络”功效的生物学基础。通络救脑注射液在降低MDA含量，提高SOD活性方面均具有显著的作用，表明其抗氧化作用可能与上两条途径均有关，体现了复方对两有效组分抗氧化作用的整合效应。

综上所述，通络救脑注射液及其有效组分栀子苷、三七总皂苷均可通过抗氧化作用有效减轻内皮细胞拟缺血损伤，提高细胞活性。栀子苷的抗氧化作用可能与抑制自由基产生和脂质过氧化反应有关，三七总皂苷可能与增强自由基的清除有关。通络救脑注射液整体上明显优于2个组分，显示了中药组方配伍发挥整合调节的治疗优势。

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［3］李卫红，王东坡，李兴广，等.通络救脑注射液及其组分对拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞的保护作用［J］.安徽中医学院学报，2011，30(6):42-46.

［4］李卫红，李澎涛，华茜，等.不同内皮细胞条件培养液对皮层神经元线粒体功能的影响及通络救脑注射液的保护作用［J］.中国中西医结合杂志，2007，27(2):131-134.

［5］朱元，李澎涛，李卫红，等.不同状态的大鼠星形胶质细胞条件培养液对脑微血管内皮细胞血脑屏障特征性酶的影响［J］.世界科学技术—中医药现代化，2012，14(2):1393-1398.

［6］司银楚，吴海霞，许红，等.通络救脑注射液对脑缺血大鼠脑皮质梗塞灶Glu及其NMDA受体表达的影响［J］.中国医药学报，2003，18(8):466-513.

［7］Rodrigo J，Fernadez AP，Serrano J，et al.The role of free radicals in cerebral hypoxia and ischemia［J］Free Radic Biol Med，2005，39(1):26-50.