高血压脑出血急性期肝阳化风证与恢复期阴虚风动证的蛋白质组学比较研究

杨 波，梁清华*，熊新贵，陈 疆，萧梅芳

（1.中南大学湘雅医院中西医结合研究所，湖南 长沙410008；2.中南大学湘雅医院远程医疗中心，湖南 长沙410008；3.中南大学湘雅医院健康管理中心，湖南 长沙410008）

高血压病脑出血是临床常见急症， 病残率及病死率均较高。 脑出血属于中医学“中风病”的范畴，肝阳化风证多见于中风病的急性期， 阴虚风动证多见于中风病恢复期或后遗症期[1]。 课题组前期运用蛋白质组学方法对高血压脑出血肝阳上亢证、 肝阳化风证血清[2]与外周血单个核细胞[3]进行了研究，发现高血压病肝阳上亢证与肝阳化风证具有相同和差异表达的蛋白质， 提示高血压病肝阳上亢证和肝阳化风证有共同的物质基础和不同的本质内涵。 我们运用比较蛋白质组学方法动态观察高血压脑出血患者急性期肝阳化风证、 恢复期阴虚风动证外周血单个核细胞的蛋白质表达变化， 以期从蛋白质组学角度进一步探讨“肝阳化风证”的本质内涵。

1 临床资料与方法

1.1 临床资料

1.1.1 诊断标准 西医诊断标准符合《中国脑血管病防治指南（2005年）》(制定的脑出血诊断标准[4]，分期标准符合2000年全国脑血管专题研讨会对脑卒中的分期标准[5]，均经过颅脑CT 证实为脑实质出血(出血部位为基底节，出血量为30 mL 以内)，基础病为高血压病(高血压3 级)所致脑出血。 肝阳化风证、阴虚风动证辨证标准参考《中医肝脏象现代研究与临床》[6]，经两位以上高级职称医师辨证评分。

1.1.2 纳入和排除标准 纳入标准：(1)符合西医疾病诊断标准、中医辨证标准及主症辨证5 级计分标准；(2)征得患者家属同意；(3)经过医院伦理委员会批准；(4)年龄19～69 岁。 排除标准：排除小脑、脑干出血，脑外伤致出血，使用抗凝剂致脑出血，肿瘤/脑血管畸形致脑出血， 混合性中风或出血性梗死，合并严重心、肝、肾功能不全、糖尿病、严重感染者[7]。

1.1.3 一般资料 10 例高血压病脑出血患者来自2009年6月～2009年10月中南大学湘雅医院神经内科住院病人，其中男8 例，女2 例，年龄45～67 岁。起病3 d 内辨证为肝阳化风证（简称肝阳化风证组），追踪观察发病后3月内辨证为阴虚风动证（简称阴虚风动证组）。全部患者入院后予降低颅内压、降血压（有效控制血压140/90 mm Hg）、控制血糖、护脑、营养神经、预防感染及应激性溃疡等相关内科保守治疗，全部病人未给予相关证型的中药处方口服。 另设10 例健康志愿者（简称健康对照组），来自湘雅医院健康管理中心，经体检符合老龄健康人条件者(参照1982年2月中华医学老年医学会规定)，男性7 例，女性3 例，年龄44～68 岁，其年龄、性别均与病例组相匹配(P＞0.05)，排除心、肝、肾等功能不全者，有活动性胃肠病变者，血液、内分泌系统疾病者及过敏体质者。

1.2 主要试剂[6]

固相pH 梯度干胶条、IPG 缓冲液、 两性电解质、覆盖液、低分子量标准蛋白质、尿素、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、 甘氨酸、Tris、CHAPS、SDS、Amersham 2-D QuantKit 均为Amersham Bioscieces 公司产品；二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺、双向凝胶电泳标准蛋白质、碳酸氢铵、三氟乙酸、乙腈、基质a-氰基-4-羟基肉桂酸、TEMED 均为Sigma 公司产品， 考马斯亮蓝G-250 为USB 公司产品；Trizol 为Invitrogen公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 实验方法

实验均在中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室完成。

1.3.1 淋巴细胞分离 高血压脑出血患者于起病3 d （辨证为肝阳化风证） 与追踪观察发病后3月（辨证为阴虚风动证）分别抽取静脉血，同时抽取对照组静脉血，参照文献[8]方法分离外周血淋巴细胞而获得单个核细胞，于-70 ℃低温冻干保存。

1.3.2 蛋白质提取及浓度测定 参考文献[3]方法称50～60 mg 淋巴细胞加入80 μL 细胞裂解液，混合液氮反复研磨， 震荡使之充分溶解， 涡旋混匀，12 000 r/min 4 ℃离心1 h，取上清液即为细胞总蛋白质。用bradford 法BCA 蛋白质定量试剂盒测定蛋白质浓度[9]，其余上清液分装置-70 ℃备用。

1.3.3 双向凝胶电泳（2-DE）[10]固相pH 梯度双向凝胶电泳： 主要按IPGphor 等电聚焦系统指南进行(IPGphor 等 电 聚 焦 仪，Amersham Pharmacia 公 司)。各组上样量均为1 mg。所得凝胶用考马斯亮蓝法染色，加入脱色液(20%乙醇)至背景完全脱色。

1.3.4 凝胶图像分析 用Imagescanner 扫描仪(Bio-Rad 公司)扫描考染的凝胶，采用PDQuest 8.0软件(Bio-Rad 公司)进行详细分析，比较蛋白斑点的差异[11]。差异点的判断有两个标准：一是有和无的差别，二是灰度值差异比率小于0.5 或大于200%为差异点，差异蛋白至少出现在3 次不同的实验中。

1.3.5 差异表达蛋白的质谱分析 切下差异表达的蛋白质点，进行脱色，胶内酶解，测定肽质量指纹图谱(PMF)，将PMF 用Mascot Distiller 软件(Matrix science)识别单同位素峰，获得的肽端的质荷比(m/z)数 值 输 入Mascot 软 件(Matrixscience，www.matrixscience.com) 检索NCBI、SwissProt 蛋白质数据库进行蛋白鉴定。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 脑出血肝阳化风证与阴虚风动证外周血单个核细胞差异蛋白质点的比较

高血压脑出血急性期肝阳化风证与恢复期阴虚风动证患者分别取静脉血提取单个核细胞总蛋白，与健康人比较，进行双向凝胶电泳，每组检测3次，重复性好，获得比较清晰的双向电泳图谱，结果如图1 所示，见封三彩图。应用PDQuest 8.0 软件进行分析，检测到肝阳化风证组与阴虚风动证组之间存在3个差异表达蛋白，提示这三个蛋白可能与脑出血不同时期证型变化有关。

2.2 脑出血肝阳化风证与阴虚风动证外周血单个核细胞差异蛋白质的质谱鉴定

对差异表达蛋白进行MALDI-TOF-MS 质谱分析， 通过Mascot 软件检索NCBI、SwissProt 数据库，初步鉴定了这3个蛋白，分别为肌动蛋白、假想蛋白片段、纤维蛋白原α 链前体。 其中肌动蛋白在脑出血肝阳化风证组、阴虚风动证组均较对照组表达下调，而在阴虚风动证组又较肝阳化风证组表达下调；纤维蛋白原α 链前体在脑出血肝阳化风证组表达上调，在阴虚风动证组表达下调。 表明这两个差异蛋白可能与脑出血肝阳化风证、阴虚风证动的发生发展密切相关。 假想蛋白在肝阳化风证组表达缺失，在阴虚风动证组表达上调，提示假想蛋白可能与阴虚风动证发展有关。 各差异蛋白在各组的表达变化趋势见表1。

表1 高血压脑出血患者肝阳化风证组、阴虚风动证组及健康对照组外周血单个核细胞差异蛋白质表达鉴定

3 讨论

课题组前期以肝阳化风证为中心， 从同病异证、异病同证、相关证、同类证等角度阐述了肝阳化风证蛋白质表达的关联性与差异性及肝风内动3个亚型相同表达的蛋白，初步获得了肝阳化风证蛋白质的表达谱及功能，为证本质的进一步研究奠定了基础[11]。本实验采用比较蛋白质组学方法，病证结合， 动态研究同一患者脑出血急性期肝阳化风证、恢复期阴虚风动证的蛋白质表达差异，是从另一角度排除“病（高血压脑出血）”的干扰，更好地进行证（肝阳化风证、阴虚风动证）本质内涵的研究。 结果发现，高血压脑出血患者，急性期肝阳化风证与恢复期阴虚风动证分别抽取静脉血提取单个核细胞总蛋白，进行双向凝胶电泳，获得了比较清晰的双向电泳图谱，采用PDQuest 分析并经质谱初步鉴定，脑出血急性期肝阳化风证与恢复期阴虚风动证之间存在3个差异蛋白，其中肌动蛋白与纤维蛋白原α 链前体两个蛋白可能与脑出血肝阳化风证、 阴虚风动证的发生发展密切相关，再一次表明中医证有其相对独特的物质基础。

研究表明脑出血急性期存在血小板活化现象， 活化的血小板可能参与了血肿周围脑水肿的形成[12]。 血小板活化的分子基础是细胞内骨架蛋白的变化，肌动蛋白是细胞骨架的组成部分，本研究发现肌动蛋白在脑出血肝阳化风证、阴虚风动证下调，且阴虚风动证较肝阳化风证下调更明显，从另一方面提示肌动蛋白表达水平可能和血小板的早期活化有关。

纤维蛋白原 （fibrinogen，Fib） 是纤维蛋白的前体，由两对α 链、β 链及γ 链组成，既是急性时相蛋白参与炎症反应，又作为体内重要的凝血物质参与凝血过程，在动脉粥样硬化及生理止血中发挥重要作用[13]。 研究表明Fib 与出血性脑卒中尤其是颅内分支小动脉硬化后所致脑实质出血呈正相关[14]。 本研究发现脑出血急性期肝阳化风证组Fib 水平较健康对照组明显升高，差异有显著性（P＜0.05），恢复期阴虚风动证较健康对照组下降， 差异具有显著性（P＜0.05）， 提示高Fib 水平与脑出血密切相关，且Fib 水平可能与出血性中风的病程有关。 因此推测Fib 可作为脑出血急性期肝阳化风证、 恢复期阴虚风动证的特异性蛋白。

脑血管病的发病基础是动脉粥样硬化。 脑出血急性期肝阳化风证为肝阳亢逆无制而表现动风的证候， 可能与细胞炎症介质反应强烈紧密关联，其中与炎性介质反应引起C 反应蛋白高水平表达、血管细胞黏附分子参与启动的动脉粥样硬化斑块有关联；阴虚风动证是阴液亏虚、筋脉失于濡养引动肝风的证候，多为疾病恢复期，病情相对稳定，炎性介质反应不强，故指标显示的异常变化较小。

肝阳化风证与阴虚风动证属于高血压脑出血同一患者， 两者必定存在着某些相同的物质基础，但由于处在不同的病变阶段(有证的不同)表现为不同的证候，这些不同的证候是由不同的蛋白质功能来体现的，由此可见，证与病有相同的物质基础，但更重要的是证本身具有物质基础(差异的蛋白质表达)，为进一步寻找证的本质奠定了基础。 然而由于病证的相对复杂性，临床获取样本量较少，尽管通过质谱分析和数据库查询，所获得的也只是部分蛋白质粗略的功能信息，因此，仍需要进一步扩大临床样本量，进一步探讨差异蛋白质的功能研究及相关验证工作。

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