穿孔膜片钳记录肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道方法初探

文 静，程 俊，杨 艳

在血管张力调节靶点大电导钙激活钾通道（large conductance Ca2+-activated K+channels，BKCa）的研究中，我们用常规全细胞膜片钳记录BKCa和由其开放所介导产生的自发性瞬时外向电流（spontaneous transient outward currents，STOCs）时，发现随着时间的推移，BKCa宏观电流的幅度越来越小且STOCs 很难记录到，或在很短时间内STOCs就完全自行消失，这可能是电极液和细胞内液相互渗透，造成胞质内容物被稀释，特别是维持离子通道功能和信号转导的物质被吸到电极内，改变了细胞内钙缓冲能力［1-2］。这极大地局限了我们对细胞内局部自发性的Ca2+释放事件的深入研究，因此寻求适用于大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞的穿孔膜片钳方法，以记录BKCa宏观电流以及STOCs，为胞内信号转导研究提供一种更为准确和稳定的实验方法。

1 材料与方法

1.1 材料 正常大鼠,雌雄不拘,体重250～300g,由泸州医学院动物房提供。木瓜蛋白酶、XI型胶原酶、二硫苏糖醇（DTT）、两性霉素B、K-aspartate 和HEPES均购自美国Sigma公司；余为国产分析纯试剂。主要实验仪器：体视显微镜（S8APO,LEICA,Germany）；微管电极拉制仪（PC-10,Narishige,Japan）；膜片钳放大器（Axopatch 200B,Axon Instruments,USA）；A/D-D/A 转 换 器（Digidata-1440A,Axon Instruments,USA）；倒置相差显微镜（Axiovert135，Zeiss，Germany）。

1.2 实验溶液的配制 溶液Ⅰ（mmol/L）（即台式液）：NaCl 127，KCl 5.9，CaCl22.4，MgCl21.2，HEPES 10，glucose 12；用3 mol/L NaOH 调pH 至7.40。溶液Ⅱ（mmol/L）为无钙台式液。全细胞浴液（mmol/L）：NaCl 134，CaCl2 1.8，MgCl2 1，KCl 6，HEPES 10，glucose 10；pH 用3 mol/L NaOH 调至7.40。全细胞电极液（mmol/L）：K-aspartate 110，KCl 30，EGTA 0.05，NaCl 10，MgCl2 1，HEPES 10；pH 用KOH 调 至7.20。酶液：酶Ⅰ（mg/ml）：木瓜蛋白酶0.45，DTT 0.325；酶Ⅱ（mg/ml）：XI型胶原酶0.75。

1.3 急性酶分离大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞 将大鼠麻醉，连同肠段一起快速取出肠系膜，固定在胶盘里，加入4℃的溶液Ⅰ，在体式显微镜下分辨动静脉，仔细剔除血管壁上的纤维结缔组织和脂肪组织，得到分离好的血管组织。将动脉血管放入含有酶液Ⅰ的玻璃小瓶中，在37℃恒温水浴箱中振荡25～30min后，快速转入酶Ⅱ中，37℃恒温水浴箱中振荡10～12min，取出组织，放人溶液Ⅱ中，轻轻吹打，得到单个肠系膜动脉平滑肌细胞，置于4℃冰箱备用。

1.4 全细胞穿孔膜片钳记录及电流记录方案 室温25℃，在倒置相差显微镜下找到表面光滑且折光性强的细胞，使玻璃微电极靠近该细胞并使电极尖端贴附在细胞表面。负压抽吸形成高阻封接（阻抗高达1GΩ以上）时，即形成细胞贴附式膜片（cell-attached patch），此后，静待两性霉素B 在细胞膜上造成孔道。在穿孔膜片形成的过程中，膜电容逐渐增大，电极的串联电阻逐渐减小，约15～20min后，两者变化趋于稳定，表明穿孔膜片已完全形成，接下来按电流方案记录电流。

全细胞BKCa 宏观电流记录采用斜坡刺激方案（保持电位在-60mV，从-80 到+60mV，斜率0.375V/s，时程400 ms）和阶跃方波脉冲方案（保持电位在-60 mV，从-60 mV 以10 mV 阶跃除极至+60 mV，时程400 ms），刺激频率1 Hz。STOCs 的记录方案采用在某一固定电位进行钳制记录，时程30s。

2 结果

2.1 运用全细胞穿孔膜片钳记录大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa本实验采用两性霉素B 全细胞穿孔膜片钳技术记录大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa宏观电流。按方波脉冲方案刺激时，当一般去极到大于-20～-10 mV左右时，有外向电流的出现，而且电流随着膜电位的增大而增大，具有一定的外向整流特性。当在较高去极电压时，可以观察到BKCa宏观电流上有STOCs 随机地叠加，呈大噪声样（图1A）。利用斜坡刺激脉冲方案引出的BKCa，为外向电流，其上叠加有STOCs（图1B）。在观察的3h 内，记录的电流无随时间变化而减小的现象。

2.2 运用全细胞穿孔膜片钳记录大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞的STOCs 在两性霉素B 全细胞穿孔膜片钳下，给予大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞不同的钳制电压，时间持续30s，观察到随着细胞膜去极化程度的增大（-30～0 mV），STOCs 的电流幅度和频率均逐渐增加，呈明显的电压依赖性（图2）。仔细观察放大的STOCs，其呈不对称的钟型，单或双尖峰样（图3），STOCs的出现具有随机性，且峰值幅度与频率均具有较大的变异性［3］。在观察的3h 内，记录的STOCs 无电流幅度及频率的变化。

图1 A.全细胞穿孔膜片钳记录的大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa宏观电流，箭头所指为叠加的STOCs B.用斜坡刺激脉冲方案引出的BKCa，箭头所指为叠加的STOCs

图2 -30～0 mV的钳制电压下，大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞上的STOCs

图3 以-10 mV下记录的大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞上的STOCs为例，箭头所指为放大的STOCs，呈单或双尖峰样

3 讨论

平滑肌细胞胞内钙浓度的增加，可以引起胞内钙库释放钙产生钙火花，局部的钙离子浓度升高激活邻近的BKCa产生STOCs，引起细胞膜的超极化，调节血管平滑肌细胞的舒张。STOCs 反应了胞内钙火花事件在膜电流上的变化，因此，STOCs是体现BKCa胞内钙敏感性的重要指标之一［4-6］。我们之前在实验中发现常规全细胞膜片钳技术很难记录到STOCs 电流,即使有记录但其持续时间较短，无法进行药物调控研究，而采用全细胞穿孔膜片钳后记录到STOCs 电流的概率明显增加，且可以维持时间长约3h，这可能是由于全细胞穿孔膜片钳保持了电极内液和胞内液之间电学的连续性，而且使细胞内环境相对稳定，通道电流的衰减现象显著减慢，某些对通道调控和胞内信号转导有重要作用的第二信使物质仍可发挥效能，离子通道生理功能保持正常［7］，相对于常规全细胞膜片钳技术实验成功率更高。值得强调的是，在实验过程中为了记到有效的电流，还应该注意到膜穿孔物质（即两性霉素B）在电极尖端内可能存在没有溶解的颗粒，这会影响高阻封接的形成；此外两性霉素B 光敏性高，整个过程均需要注意避光，因此两性霉素B的充分溶解与避光保存对实验的成功极为重要。两性霉素B 难溶于水，要用有机溶剂二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide,DMSO）溶解，且电极液中DMSO终浓度不能超过0.3%。需特别注意其电极液的具体配置方法：将l mg 的两性霉素B 溶解于l0μl DMSO中，置于超声振荡器中约15～20min 溶解至橘黄色透明液体后，将5ml 全细胞电极液加入到该溶解液中，用注射器反复吹打，加速混匀，这样含两性霉素B 的全细胞穿孔膜片钳电极液（终浓度200μg/ml）制备完成，于4℃冰箱保存。有报道新鲜配置的穿孔电极液的有效时间仅为2～3h，需要现配现用，但是在我们之前的实际应用过程中发现使用2天后依然有效［7］。

［1］刘振伟.实用膜片钳技术［M］.北京：军事医学科学出版社,2006：120-121.

［2］杨艳,曾晓荣,刘智飞，等.酶分离猪冠脉平滑肌细胞钙激活钾通道全细胞记录电学特性研究［J］.泸州医学院院报,2003,26（6）：473-476.

［3］潘雪,李向楠,王鹏，等.RyR 与PKC 在UTP 对猪冠状动脉平滑肌上STOCs 调控中的作用［J］.中国老年学杂志,2010,30（13）1815-1819.

［4］Jaggar JH,PorterVA,Lederer WJ,et al.Calcium sparks in smooth muscle［J］.Am J Physiol Cell Physiol,2000,278（2）：C235-256.

［5］Wellman GC,Nathan DJ,Saundry CM,et al.Ca2+sparks and their function in human cerebral arteries［J］.Stroke,2002,33（3）：802-808.

［6］Furstenau M,Lohn M,Ried C,et al.Calcium sparks in Human coronary artery smooth muscle cells resolved by Confocal imaging［J］.Hypertens,2000,18（9）1215-1222.

［7］李鹏云,曾晓荣,杨艳，等.穿孔膜片钳技术在离子通道电流研究中的应用［J］.四川生理科学杂志,2006,28（2）：62-65.