铁棒锤氯仿部位的毒-效关系研究

黄先菊，胡 超，苏慧娟，杨宝成，刘翠芳

(中南民族大学 药学院，武汉430074)

铁棒锤，别名雪上一枝蒿、三转半，收载于《部颁标准》(藏药分册)［1］、《羌族医药》［2］，性苦、微辛，热，有剧毒，以宁夏产铁棒锤为地道产品，是民间常用中草药之一.铁棒锤的药用部位为其干燥块根，主要用于风湿性关节炎、关节痛、跌打瘀痛、毒热、肿瘤等疾病的治疗［3］.铁棒锤含有乌头碱(aconitine)、去氧乌头碱、3-乙酰乌头碱(3-acetylaconitine)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、华北乌头碱(songorine)、牛七碱(napeuonine)、纳派林碱、伏乌碱(flavaconition)等生物碱［4］.其中，乌头碱类生物碱既是药用成分，又是毒性成分，它能刺激局部皮肤，使皮肤黏膜感觉神经末梢呈兴奋现象，产生瘙痒与灼热感，继以麻醉，丧失知觉［5］，故在临床上常用于治疗多种痛症，如头痛、胁痛、痹痛、癌痛等.

本研究旨在比较铁棒锤的3个不同提取部位(石油醚、氯仿、正丁醇)LD50，并基于铁棒锤的药用成分又是毒性成分这一特性，选择3个有效部位中毒性最大的部位通过热板和扭体实验探讨其对中枢性疼痛和炎性疼痛的镇痛作用，并与铁棒锤的整体药效比较，初步揭示其镇痛作用与毒性的关系.

1 材料和方法

1.1 动物

昆明小鼠，SPF级，体重18～22 g，购自于湖北省实验动物中心［SCXK(鄂)2008-0005］，饲养于中南民族大学药学院SPF级动物房，可自由进水进食，实验前12 h前开始禁食，不禁水.

1.2 试药和仪器

铁棒锤干燥块根购自于安徽亳州，经中南民族大学药学院刘新桥副教授鉴定.醋酸(德国默克公司)，阿司匹林泡腾片(中国阿斯利康制药有限公司)，吗啡注射液(中国东北制药集团)，乙醇、硫酸、石油醚和氯仿(国药集团化学试剂有限公司)，甲醇(色谱纯，TEDIA Company).

秒表、RCY-2型热板仪(冀星实验仪器有限公司)，电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，Ultimate3000高效液相色谱仪(戴安中国有限公司).

1.3 铁棒锤氯仿部位的制备

将铁棒锤块根粉碎，称取适量，置于圆底烧瓶中，加入乙醇使粉末完全浸泡于乙醇中，电热套加热回流3次，分别为1，2，3 h，抽滤得滤液，45℃真空旋转蒸发至干.所得膏状物用2%H2SO4溶解，石油醚脱脂后，以氨水调pH=9后用氯仿分2次萃取，合并氯仿部位的萃取液，旋蒸浓缩后烘干，得到铁棒锤氯仿提取物粉末.

1.4 色谱条件

色谱柱 Thermo Scientific Syncronis C18(4.6×250 mm，5 μm)，甲醇-0.1%三乙胺梯度洗脱，检测波长是240 nm，柱温为30℃，进样量10 μL，流速1 mL/min.

1.5 铁棒锤提取部位的急性毒性实验

按照受试样品的不同急性毒性，分别设置氯仿部位剂量组(78.13，62.5，50，40，32，25.6，20.48 mg/kg)、石油醚部位剂量组(3000，5000，8333 mg/kg)、正丁醇部位剂量组(3000，5000，8333 mg/kg)和空白对照组，每组10只小鼠，雌雄各半.以灭菌水溶药，按0.4 mL/25 g一次性灌胃给药，连续观察7 d，并记录小鼠的中毒表观特征，包括小鼠中毒的外观表现(主要是呕吐、腹式呼吸、怠动和腹泻，集中在给药后前4 h)，和给药后4 d内的总死亡数，.由前者判断小鼠的最低中毒剂量，由后者各个剂量的累积死亡量用SPSS软件计算LD50.

1.6 热板法实验

［6，8］，将小鼠放在预热至55℃的恒温水浴器金属底板上，保持水温恒定，以小鼠接触热板至舔后足反应的时间(s)为该小鼠的痛阈值，选定痛阈值在5～30 s的小鼠进行实验，超出此范围或跳跃者弃之不用.筛选合格小鼠60只，按体重随机分为6组，每组10只，灌胃给药0.1 mL/10 g，包括空白对照组(生理盐水)、阳性对照组(10 mg/kg吗啡组)、铁棒锤总提物20 mg/kg，铁棒锤氯仿部位20，10，5 mg/kg组.重复3次正常痛阈测量，取平均值为该鼠给药前痛阈值.给药前痛阈值超过30 s或低于5 s的小鼠均淘汰.分别测定小鼠给药后30，60，90 min的痛阈值.为避免组织损伤，如痛阈值超过60 s，即停止测试而按60 s记录.镇痛百分率=(给药后痛域值–给药前痛域值)/(给药前痛域值)×100%.

1.7 小鼠扭体实验

实验在恒温实验房中进行防止室温较低.参考文献［6，8］，避免小鼠性别差异，选取雌性昆明种小鼠70只，随机分成7组，每组10只，灌胃给药0.1 mL/10 g，包括空白对照组(生理盐水)、阳性对照组(200 mg/kg阿斯匹林)、铁棒锤总提物20 mg/kg，铁棒锤氯仿部位20，10，5 mg/kg.各组分别灌胃给药30 min后，按0.1 mL/kg腹腔注射0.6%冰醋酸溶液，记录小鼠30 min内的扭体次数(腹部肌肉收缩同时后腿伸展为扭体一次).扭体抑制率=(空白对照组平均扭体数–给药组平均扭体数)/(空白对照组平均扭体数)×100%.

1.8 统计学处理

2 实验结果

2.1 铁棒锤氯仿部位的HPLC色谱图

铁棒锤氯仿部位的HPLC的色谱图如图1(e)所示，铁棒锤氯仿部位含有苯甲酰乌头碱、新乌头碱、乌头碱和雪上一枝蒿甲素，其中雪上一枝蒿甲素含量最高，新乌头碱和乌头碱含量较低.

图1 铁棒锤生物碱成分HPLC色谱图Fig.1 The HPLC chromatograms of alkaloid ingredients from chloroform extract of Aconitum Pendulum Busch.

2.2 铁棒锤提取部位的急性毒性

铁棒锤各提取部位给药中毒的表现包括干呕、腹式呼吸、松毛、活动量减少、抓嘴、出汗、流涎、便秘、眼球凸起的中毒症状，严重的致死.铁棒锤各提取部位的急性毒性结果见表1，由SPSS软件处理数据可得到铁棒锤氯仿部位、石油醚部位、正丁醇部位3种不同活性成分的 LD50分别为 37.514，6766.928，5492.337 mg/kg.可见铁棒锤不同部位对小鼠急性毒性强度差别较大，其中氯仿部位毒性最强，其次为正丁醇部位和石油醚部位.

表1 铁棒锤不同提取部位的急性毒性Tab.1 The acute toxicity of different extracts of Aconitum Pendulum Busch.

2.3 铁棒锤氯仿部位对热板法小鼠痛阈值的影响

热板法实验数据结果见表2.由表2可见，铁棒锤氯仿部位各组在给药后30，60，90 min后均能显著提高小鼠的痛阈值，较空白组均有显著性差异.5～20 mg/kg铁棒锤氯仿部位呈现剂量依赖的镇痛作用，20 mg/kg氯仿部位的镇痛百分率远低于阳性对照吗啡组(p＜0.01)，但高于同剂量的铁棒锤总提物组(p＜0.05).可见在中枢性疼痛方面，20 mg/kg氯仿部位的镇痛作用优于同剂量铁棒锤的总提物，但弱于阳性对照药吗啡.

表2 铁棒锤氯仿部位对小鼠痛域的影响(D，n=10)Tab.2 The analgesic effect of chloroform extract of Aconitum Pendulum Busch.

表2 铁棒锤氯仿部位对小鼠痛域的影响(D，n=10)Tab.2 The analgesic effect of chloroform extract of Aconitum Pendulum Busch.

与对照组比较，*p＜0.05，＊＊p＜0.01

组别 给药前痛域值/s 给药后痛域值/s 镇痛百分率/%30 min 60 min 90 min 20 mg/kg氯仿部位 25.3±7.7 45.1±16.5＊＊ 52.8±13.7＊＊ 50.9±14.4＊＊30 min 60 min 90 min 78.3 108.7 101.2 10 mg/kg氯仿部位 13.8 ±3.1 23.7 ±14.6 25.2 ±7.7* 23.8 ±8.3 71.7 82.6 72.5 5 mg/kg氯仿部位 17.3 ±5.2 26.4 ±4.0* 28.5 ±10.6＊＊ 27.7 ±7.3* 52.6 64.7 60.1 20 mg/kg 总提物 23.0 ±4.3 38.5 ±4.3＊＊ 40.3 ±4.8＊＊ 40.1 ±5.0＊＊ 67.4 75.2 74.3 10 mg/kg 吗 啡 15.1 ±4.8 45.2 ±12.0＊＊ 54.6 ±5.4 53.0 ±12.3＊＊ 199.3 261.6 251.0空白对照 17.6 ±5.2 18.4 ±2.7 15.2 ±4.8 19.6 ±5.4– – –

铁棒锤氯仿部位各给药组在给药后30，60，90 min的时效关系见图2，图2表明铁棒锤20，10，5 mg/kg给药组均在约60 min镇痛率最高，给药90 min后镇痛药效减退.

图2 铁棒锤氯仿部位对小鼠镇痛的时效关系Fig.2 The time-effect relationship of analgesia of chloroform extract of Aconitum Pendulum Busch.in mice

2.4 铁棒锤氯仿部位对扭体反应的影响

铁棒锤氯仿部位对扭体反应的影响如表3所示，20，10，5 mg/kg铁棒锤氯仿部位均能明显抑制小鼠腹腔注射冰醋酸所致扭体反应，其中铁棒锤20，10，5 mg/kg组抑制率分别为 76.4%、33.2%、13.0%.20 mg/kg铁棒锤氯仿部位的疼痛抑制率(76.4%)显著高于 200 mg/kg阿司匹林组(50.5%)和同剂量的总提物组(51.0%)，p ＜0.01.可见在炎性疼痛方面，20 mg/kg铁棒锤氯仿部位镇痛作用最好.

表3 铁棒锤氯仿部位对小鼠扭体反应的影响(D，n=10)Tab.3 The analgesic effect of chloroform extract of Aconitum Pendulum Busch.at writhing test

表3 铁棒锤氯仿部位对小鼠扭体反应的影响(D，n=10)Tab.3 The analgesic effect of chloroform extract of Aconitum Pendulum Busch.at writhing test

与对照组比较，*p＜0.05，＊＊p＜0.01

/%20 mg/kg氯仿部位 4.9 ±5.6＊＊组别 扭体次数 抑制率76.4 10 mg/kg氯仿部位 13.9 ±11.2 33.2 5 mg/kg氯仿部位 18.1 ±15.1 13.0 20 mg/kg总提物 10.2±5.7＊＊ 51.0 200 mg/kg阿司匹林 10.3±5.2＊＊ 50.5空白对照 20.8 ±8.5–

3 讨论

铁棒锤氯仿部位的LD50为37.514 mg/kg，明显低于正丁醇部位的5492.337 mg/kg和石油醚部位的6766.928 mg/kg，说明其为铁棒锤主要毒性部位，由于氯仿部位中乌头碱类生物碱含量较高.

小鼠扭体法和热板法均为筛选药物镇痛作用的经典实验方法［7］.分别适用于针对炎性疼痛和中枢性疼痛的药物筛选.本文以民族药铁棒锤为研究对象，分别用热板法和扭体法考察了不同剂量的铁棒锤氯仿提取物的镇痛作用.结果表明:热板实验中不同剂量的铁棒锤氯仿部位均能显著提高小鼠的痛域值，其镇痛效果弱于阳性对照药吗啡，但强于同剂量的铁棒锤总提物.扭体实验结果表明不同剂量的铁棒锤氯仿部位均能显著抑制腹腔注射醋酸所致的小鼠扭体反应，显著优于阳性对照药阿司匹林组和同剂量的铁棒锤总提物，说明铁棒锤氯仿部位具有显著的镇痛活性，效果优于阿司匹林，对炎性疼痛的疗效强于中枢性疼痛.

20 mg/kg铁棒锤氯仿部位的中枢性和炎性镇痛作用均明显优于同剂量的铁棒锤总提取物［8］.因其纯化后镇痛效力增强，或其为镇痛和毒性作用的主要活性部位，故该部位的镇痛作用与其毒性存在一定的关联.

铁棒锤属于乌头类中药，其主要成分是二萜类双酯型生物碱，如乌头碱、中乌头碱、次乌头碱等［9］.虽然其乌头碱类生物碱的含量一般均小于1%，但其毒性很高，乌头碱、中乌头碱、次乌头碱小鼠经口 LD50分别为1.8，1.9，5.8 mg/kg［10］;人口服乌头碱0.12 mg即可中毒，3～5 mg可使人致死.故铁棒锤等乌头类中药具有很好的药用价值，但也具有一定的毒性，需要进一步研究如何降低其毒性和增强其疗效.

参考文献

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［2］张 艺，钟国跃.羌族医药［M］.北京:中国文史出版社，2005.

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［6］徐叔云.药理实验方法学.4版［M］.北京:人民卫生出版社，2010:700-714.

［7］陈建双，亢 炎，佟继铭.赤雹果总有机酸镇痛作用研究［J］.江苏中医药.2011，43(11):84-85.

［8］Ren Wei，Yuan Lin，Li Jun，et al.Ethanolic extract of Aconiti Brachypodi Radix attenuates nociceptive pain probably via inhibition of voltage-dependent Na+channel［J］.Afr J Tradit Complement Altern Med，2012，9(4):574-583.

［9］李娅萍，田颂九，王国荣.乌头类药物的化学成分及分析方法概况［J］.中国中药杂志，2001，26(10):659-662.

［10］黄泰康.常用中药成分与药理手册［M］.北京:中国医药科技出版社，1994:821-928.