HPLC-QTOF MS 和 MS/MS分析鉴定PF573228肝微粒体体外代谢产物

王 献, 王 玲

(中南民族大学 化学与材料科学学院, 武汉 430074)

黏着斑激酶(FAK)是一种细胞质酪氨酸蛋白激酶，在正常细胞和癌细胞中均发挥着关键的调控作用，与细胞的黏附、伸展、迁移、增殖和凋亡等行为密切相关[1].FAK的抑制剂分子能够有效抑制FAK活性，对肿瘤细胞增殖和迁移有明显的抑制效果[2].PF573228是一种有效的、高选择性的FAK蛋白抑制剂，它是ATP与FAK蛋白特异性结合的竞争性抑制剂[3].本文采用高效液相色谱和四极杆飞行时间串联质谱(HPLC-QTOF-MS/MS)技术[4]，建立了一种简单、快捷、高效的方法，分离检测了PF573228与肝微粒体体外代谢物，通过二级质谱MS/MS鉴定了PF573228的代谢产物的结构并推测了其代谢裂解途径.

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

高效液相色谱仪(Agilent 1200，美国)，四极杆飞行时间质谱仪(Agilent 6520 Q-TOF MS，美国)，超纯水机(Molelement 1815a 摩尔元素型,上海摩勒科学仪器有限公司)，高速冷冻离心机(GL-20M, 上海卢湘仪离心机仪器有限公司)，色谱柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18, 美国Agilent)，高精度数控摇床(SH2-03, 上海堪鑫仪器设备有限公司),水浴氮吹仪(CM-12, 北京成萌伟业科技有限公司),色谱柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18, 美国Agilent).

SD雌大鼠肝微粒体(20 mg/mL, 广州诺嘉生物科技有限公司)，超纯水(18.25 MΩ)，PF573228(纯度>98%)，6-磷酸葡萄糖(纯度≥98%)，6-磷酸葡萄糖脱氢酶(200～400 U/mg)，NADP(纯度≥98%)，磷酸钾缓冲盐(纯度 ≥98%, Sigma-Aldrich公司)，甲醇、乙腈(色谱纯, 美国Waltman)，氯化镁(分析纯)，乙酸乙酯(色谱纯, 天津科密欧化学试剂有限公司).

1.2 PF573228在大鼠肝微粒体系中的代谢反应

PF573228在大鼠肝微粒体系中的代谢反应孵育方法参照文献[5～8]进行了优化，PF573228用DMSO溶解后用超纯水稀释，用200 mL超纯水溶解磷酸钾缓冲盐药片，完全溶解后，磷酸盐缓冲液浓度为0.1 mol/L(pH 7.4)，用超纯水配制浓度为5.0×10-3mol/L氯化镁溶液，6-磷酸葡萄糖浓度为0.1 mol/L，6-磷酸葡萄糖脱氢酶浓度为10 U/mL，NADP浓度为2.0×10-2mol/L.向1.5 mL的EP管中加入磷酸盐缓冲液200 μL，PF573228溶液20 μL，肝微粒体40 μL，氯化镁40 μL，6-磷酸葡萄糖40 μL，6-磷酸葡萄糖脱氢酶20 μL，混匀后置于37 ℃恒温水浴摇床中预孵育5 min后加入40 μL NADP启动代谢反应，37 ℃孵育30 min后，加入乙酸乙酯共计600 μL终止反应并萃取，静止萃取10 min后经10000 r/min离心10 min，取上清液经40 ℃氮气流吹干，所得残余物质用1 mL乙腈溶解，完成后进样检测.

1.3 色谱-质谱条件

在ESI-Q-TOF MS的正离子模式下进行PF573228原药和代谢产物检测.待测样品由自动进样器以标准进样方式进样.液相色谱的流动相A为超纯水，B为乙腈，流速为0.2 mL/min，梯度洗脱条件：0～8 min 20%～45% B，8～20 min 55% B，20～24 min 80% B，24～30 min 20% B.电喷雾质谱的条件：干燥气温度为300℃；干燥气流速为11 L/min；喷雾器压力为35 Psig；毛细管电压为3500 V；碎裂电压为125 V，质谱采集范围为50-1000m/z，碰撞电压为40 eV、35 eV.

2 结果与讨论

2.1 PF573228经大鼠肝微粒体体外代谢产物鉴定

在肝微粒体CYP450酶的作用下，PF573228经一相代谢反应采用HPLC/Q-TOF MS和MS/MS二级质谱分析得到分子离子及其特征碎片离子峰，结果见图1.由图1可见，在ESI离子源作用下，m/z492经初步碰撞诱导解离，产生的m/z169的碎片离子峰和m/z323(-C8H9SO2)的碎片离子峰是C-N键断裂产生，裂解产生的m/z251(-C3H5ON)碎片离子峰是m/z323的碎片离子苯环旁边五元环断裂得到，而碎片离子m/z90(-C5H2N3F3)则是m/z251的碎片离子中间环上C-N键断裂产生的.

a)原药PF573228 LC-MS提取离子(EIC)流图;b)PF573228的ESI-MS质谱图; c)PF573228在40 eV下的碰撞诱导解离二级质谱图(ESI-MS/MS)图1 PF573228提取离子流图(TIC)和质谱图Fig.1 Extracted ion chromatogram(EIC) and mass spectra of PF573228

根据PF573228的结构特点和肝微粒体的代谢规律，推断PF573228经肝微粒体体外代谢产物的可能结构和保留时间(见表1).根据精确质量数、同位素分布、二级质谱图特征碎片离子等信息对可能的代谢物进行了定性分析，鉴定了PF573228在体外经肝微粒体的I相代谢途径和代谢产物结构[9-12].

表1 PF573228经肝微粒体体外代谢产物相关信息

代谢产物M1保留时间和碎片离子质谱分析结果如图2a，2b，2e和图3所示.由图可见，M1分子离子峰m/z508裂解去一分子水，产生m/z490(-H2O)碎片离子峰，与代谢产物M2结构一样，进一步裂解去酰胺基产生m/z450(-NCO)碎片离子峰，旁边苯环C-N断裂产生m/z169(-C8H9SO2)碎片离子峰与原药M0的特征峰是一样的.

a) PF573228三种代谢产物LC-MS提取离子流图(EIC); b～d) 代谢产物M1、M2、M3的ESI-MS质谱图; e) M1在35 eV下的碰撞诱导解离二级质谱图(ESI-MS/MS)图2 PF573228代谢产物的提取离子流图(EIC)和质谱图Fig.2 The extracted ion chromatogram(EIC) and mass spectra of the metabolites of PF573228

代谢产物M2的EIC图和分子离子峰的质谱分析结果如图2a, 2c所示，对代谢产物M1结构分析可知M1脱去一分子的水后结构和代谢产物M2是一样的，其特征离子峰m/z450、m/z320、m/z169与M2的特征离子峰是一样，裂解去酰胺基产生m/z450(-NCO)碎片离子峰，旁边苯环C-N进一步断裂产生m/z169的碎片离子峰和m/z282的碎片离子峰.图3中也说明了代谢产物M2的裂解途径.

代谢产物M3的EIC图和分子离子峰的质谱分析结果如图2a, 2d所示，代谢产物M3是N-脱烷基化得到的代谢产物，其分子离子峰m/z324二级质谱图的特征碎片离子m/z162是中间N与嘧啶环上的C裂解产生的.在药物PF573228的二级质谱图1c中可见此类C-N的断裂.

图3 代谢产物M1的ESI-MS/MS的裂解途径Fig.3 The ESI-MS/MS fragmentation of the metabolite M1

2.2 PF573228在肝微粒体体外代谢的代谢途径

根据HPLC-ESI-TOF MS和MS/MS分析结果推测，PF573228在大鼠肝微粒体P450酶系的作用下的转化如图4所示.肝微粒体中细胞色素P450酶系在转化阶段起着非常重要的作用，药物在实验对象体中发生生物转化，根据药物Ⅰ相代谢反应有氧化、还原或水解等类型.说明PF573228经肝微粒体体外代谢产物的生物转化有3个主要途径：脱氢，N-脱烷基和加氧.

a) 羟基化; b) 脱氢; c) N-脱烷基作用图4 PF573228肝微粒体体外代谢的代谢途径示意图Fig.4 The schematic diagram for the metabolic pathway of PF573228 with liver microsome in vitro

参 考 文 献

[1] Li S F, Hua Z C , FAK expression: regulation and therapeutic potential[J]. Adv Cancer Res, 2008, 101: 45-61.

[2] Hao H, Naomoto Y, Bao X, et al. Focal adhesion kinase as potential target for cancer therapy (Review)[J]. Oncol Rep, 2009, 22(5): 973-979.

[3] Slack-Davis J K, Martin K H, Tilghman R W, et al. Cellular characterization of a novel focal adhesion kinase inhibitor[J]. J Biol Chem, 2007, 282(20):14845-14852.

[4] Raju B,Ramesh M,Borkar R M,et al.Invivometabolic investigation of moxifloxacin using liquid Chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry in combination with online hydrogen/deuterium exchange experiments[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2012, 26(16): 1817-1831.

[5] Lu X, Zhao X J, Bai C ,et al. LC-MS-based metabonomics analysis[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2008, 866(1/2):64-76.

[6] Liu H, Wang K, Tang Y, et al. Structure elucidation of invivoandinvitrometabolites of mangiferin[J]. J Pharmaceut Biomed, 2011, 55(5): 1075-1082.

[7] Qi P, Fan M, Li Z, et al.Invivometabolism study of vaccarin in rat using HPLC-LTQ-MSn[J] . Biomed Chromatogr, 2013, 27(1): 96-101.

[8] Yang J, Qian D W, Jiang S, et al. Identification of rutin deglycosylated metabolites produced by human intestinal bacteria using UPLC-Q-TOF/MS[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2012, 898: 95-100.

[9] Beuck S, Schänzer W, Thevis M. Investigation of theinvitrometabolism of the emerging drug candidate S107 for doping-preventive purposes[J]. J Mass Spectrom, 2011, 46(2): 112-130.

[10] Dai H X, Wang M M, Li X R, et al. Structural elucidation ofinvitroandinvivometabolites of cryptotanshinone by HPLC-DAD-ESI-MSn [J]. J Pharmaceut biomed , 2008, 48(3): 885-896.

[11] Zhu Y Q, Zhou J. Identification of the Significant involvement and mechanistic role of CYP3A4/5 in clopidogrel bioactivation[J]. ACS Med Chem Lett, 2012, 849(3) : 844-849.

[12] Anari M R, Sanchez R I, Bakhtiar R, et al. Integration of knowledge-based metabolic predictions with liquid chromatography data-dependent tandem mass spectrometry for drug metabolism studies: application to studies on the biotransformation of Indinavir [J]. Anal Chem, 2004, 76(3): 823-832.

[13] Lopez L L, Yu X, Cui D, et al. Identification of drug metabolites in biological matrices by intelligent automated liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 1998, 12(22): 1756-1760.