真菌性角膜炎的病原菌鉴定和药物敏感性分析

贺 丹，张晓威，2，郝继龙，万 雪，单秋实，王 丽＊

（1.吉林大学基础医学院 病原生物学系，吉林大学真菌研究中心，吉林 长春130021；2.长春市儿童医院 检验科，吉林 长春130061；3.吉林大学第一临床医院 眼科，吉林 长春130021）

真菌性角膜炎是一种在世界范围内广泛流行的较顽固的真菌感染，常伴有化脓性感染、角膜溃疡及视力受损，甚至可导致失明或者失去患眼，严重影响患者的健康和生活质量。近年来，由于植物性角膜外伤的增多，隐形眼镜的使用不当，抗生素、激素的广泛使用等原因，导致真菌性角膜炎的发病率明显增高[1－5]。该病发病隐匿、进展迅速、不易诊断，且有效的眼部抗真菌药数量较少、疗效较差，致盲率较高，倍受真菌学研究者与眼科医生的关注。因此，掌握真菌性角膜炎病原真菌种类、药物敏感性等特点，了解发病易感因素、高发年龄、多发季节等流行病学规律，对于该病的早期诊断和有效治疗具有重要的意义。

本研究收集了7年间就诊于吉林大学附属临床医院眼科，疑似真菌性角膜炎患者的角膜刮片标本及相关临床资料，进行了病原菌鉴定、流行病学调查及药物敏感性检测，为临床真菌性角膜炎的诊治积累了有用的资料。

1 材料与方法

1.1 采集标本 角膜刮片标本采集自2004年10月至2012年9月，就诊于吉林大学附属临床医院眼科256例疑似真菌性角膜炎患者。

1.2 主要试剂 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）购于美国Difco公司，科玛嘉（CHROmagar）显色培养基购于郑州博赛生物技术研究所。伊曲康唑（ICZ）、两性霉素B（AmB）、伏立康唑（VCZ）购于美国Sigma公司，纳他霉素（NTC）购于德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.3 病原真菌分离、培养 将角膜刮片标本接种于2ml PDB培养基中，28℃、110rpm振荡培养72h后，如见浑浊或菌丝生长，将其接种于PDA平板培养基28℃培养。逐日观察菌落生长情况，记录其形态特征。1个月后仍未见生长的标本结束培养。

1.4 病原真菌鉴定 对丝状型菌落采用小琼脂块儿培养法、乳酸酚棉兰染色，根据显微镜下观察菌丝有无分隔、分生孢子形状、大小、排列、颜色等特征进行鉴定。对酵母及类酵母型菌落采用革兰染色，根据芽生孢子等形态特征做初步鉴定；进一步将其接种于科玛嘉显色培养基，35℃培养48h，根据菌落的形态、颜色等特征进行分型鉴定。

1.5 体外药物敏感性检测 选择临床感染较常见的茄病镰刀菌（28株）、烟曲霉（12株）及光滑假丝酵母（10株）作为受试菌株。参考美国临床和实验室标准协会（CLSI）的微量液基稀释法，即酵母菌M27－A2方案和丝状真菌M38－A方案，检测受试菌株对 AmB、ICZ、VCZ及 NTC 的敏感性[6，7]。以克柔假丝酵母（Candida krusei，ATCC 6258）和近平滑假丝酵母（Candida paapsilosis，ATCC 22019）作为质控菌株。将菌株孢子悬液接种于药敏板后35℃培养，假丝酵母生长24h、丝状真菌生长48h后，判读结果，4种药物均以100% 受抑制作为最小抑菌浓度（MIC）判定终点。计算 MIC值、MIC范围、算术平均值及几何平均值。

1.6 流行病学分析 利用SPPS 13.0统计学分析软件，对真菌性角膜炎患者的性别、年龄、季节、职业、诱发因素等信息及药物敏感性进行分析。

2 结果

2.1 病原真菌鉴定结果

256例疑似真菌性角膜炎患者标本中，单一真菌感染者158例，真菌和细菌混合感染者12例，两种真菌混合感染者12例，182例患者被诊断为真菌性角膜炎。真菌培养阳性率为71.1%，共分离、鉴定了16属29种194株真菌菌株。病原菌以镰刀菌属为主（47.0%），其中茄病镰刀菌最常见（32.0%，图1）；其次为曲霉属 （20.6%）和假丝酵母属（14.4%）（图2）。

2.2 流行病学调查结果

图1 茄病镰刀菌的形态学特征

图2 194株分离真菌菌株的种属分布情况

临床检查发现大部分患者具有眼痛、畏光、流泪、分泌物增多、角膜上皮缺损、有边界不清的白色膏状浸润灶、球结膜充血、视力下降、化脓性感染、抗生素治疗无效等典型的临床症状。患者平均年龄为49.9±11.9 岁，其中41－60岁最易发生感染（59.3%）。男女比例为1.3∶1。以秋季发病率最高（39.0%）。农民居多，占81.3%。有角膜外伤史者占29.1%，曾使用抗生素、激素及抗真菌药物治疗史者占57.7%。

2.3 体外药物敏感性检测结果

质控菌株克柔假丝酵母和近平滑假丝酵母重复3次药物敏感性试验（以下简称药敏试验），MIC结果均在CLSI公布的标准范围内，表明该药敏试验体系符合标准。利用该体系对50株茄病镰刀菌、烟曲霉、光滑假丝酵母进行了ICZ、VCZ、AmB及NTC4种抗真菌药的敏感性检测（表1－3）。

目前，国际上尚未见公认丝状真菌MIC范围，有研究认为对AmB的MIC≥2μg／ml时可能存在耐药现象；对NTC的MIC≤16μg／ml为敏感范围；对ICZ的MIC＜1μg／ml为敏感，MIC≥1μg／ml为耐药；VCZ的 MIC＜4μg／ml为敏感，而 MIC≥8 μg／ml为耐药[8]。本研究结果表明，受试茄病镰刀菌对NTC全部敏感，对ICZ均不敏感；其对AmB的MIC几何平均值最低。受试烟曲霉和光滑假丝酵母对AmB仅分别有50%和80%敏感，对其他3种药物均敏感；对ICZ的MIC几何平均值最低。

采用Friedman Test分别对3种主要病原真菌进行4种不同抗真菌药的多个配对样本的秩和检验（＞16者按32处理），结果显示4种抗真菌药之间差异有统计学意义（均为P＜0.05）。利用Kruskal Wallis Test分别对4种药物进行3种不同病原菌之间的多个独立样本的秩和检验，结果显示对于AmB差异无统计学意义（P＞0.05），而对ICZ、VCZ及 NTC，3种病原菌之间的差异有统计学意义（均为P＜0.05）。表明NTC对茄病镰刀菌抑制效果最佳，而ICZ对烟曲霉和光滑假丝酵母抑制效果最佳。

表1 28株茄病镰刀菌的 MICs（μg／mL）

表2 12株烟曲霉的 MICs（μg／mL）

表3 10株光滑假丝酵母的MICs（μg／mL）

3 讨论

菌性角膜炎的病原菌多达56属105种[4，9]。由于气候、环境及地理条件等多种因素的影响，导致真菌性角膜炎的发病率及其病原菌谱，在各个国家和地区间存在差异[4，5，10－13]。因此，掌握真菌性角膜炎的病原学特点及流行病学规律，有利于更好的制定预防、诊断及治疗策略，满足眼科医生和患者的需求。本研究结果表明，吉林省真菌性角膜炎病原菌以镰刀菌为主，其中茄病镰刀菌最常见，与我国其他地区调查结果一致[2，14，15]。美国的Tanure等[13]研究发现该病病原菌中，白假丝酵母超过镰刀菌约占46%，印度的Sengupta等[16]研究发现19%的感染是由白假丝酵母引起的假丝酵母性角膜炎。而本研究发现光滑假丝酵母引起的感染较多见，考虑可能与患者早期预防性或治疗性使用抗真菌药物有关，导致耐药性较高的光滑假丝酵母等非白假丝酵母的分离率增高。

由于吉林省是我国粮食的主要产区，从事农作人口较多。本研究调查结果显示80%以上的患者是农民，41－60岁中老年和男性发病较多，部分患者有植物或异物外伤史，以秋季农忙时节发病较多，提示在农村从事劳作时应注意防止发生角膜外伤，以减少真菌感染的发生。此外，研究还发现近60%的患者有不合理用药史，提示一旦出现感染症状应及早到医院就诊，临床医生应结合外伤史可虑真菌感染的可能，根据实验室检查结果给予合理的药物治疗。

药物敏感性检查结果表明，3种主要病原真菌对NTC均敏感，烟曲霉和光滑假丝酵母对ICZ敏感，但茄病镰刀菌对ICZ耐药。提示临床上确诊为茄病镰刀菌感染可选择NTC治疗，而其它两种病原菌感染可选择ICZ治疗。如根据患者典型症状高度怀疑是真菌感染时，在未获得实验室准确诊断前可首先选择NTC滴眼液，进行预防性局部抗真菌治疗，有利于控制病情的发展，对于改善预后具有重要意义。

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