慢病毒介导Shh基因转染对甲状腺乳头状癌细胞生物学性状的影响

边学海，徐为然，张 广，张纯海，周 乐，李世杰，孙 辉

（1.吉林大学中日联谊医院 甲状腺外科，吉林 长春130033；2.吉林大学第一医院 内镜中心）

Sonic hedgehog信号通路涉及到肿瘤细胞的生长、凋亡、转移等多个方面[1－3]。该通路的启动信号Shh蛋白在人甲状腺乳头状癌（PTC）组织中的表达增高，并与分期及淋巴结转移有关，提示Shh可能促进PTC细胞的增殖和转移[4，5]。已构建的pGC－FU－Shh－GFP慢病毒载体可成功转染PTC原代细胞，并稳定过表达Shh[6]。我们用Shh慢病毒载体转染过表达Shh基因，观察对PTC细胞的增殖、侵袭和迁移能力的影响，及Sonic hedgehog通路相关基因表达变化，试图为PTC提供潜在的治疗靶点。

1 材料和方法

1.1 材料 实验用PTC原代细胞由吉林大学基础医学院组织胚胎学系提供[7]。慢病毒载体pGC－FU Vector，293T（GENECHEM，上 海），Lipofectamine 2000（Invitrogen），Polybrene病毒感染试剂（Sigma），dNTP（Takara），250bp DNA ladder Marker（捷瑞）。根据GenBank中人Shh基因序列（NM＿000193.2）采用软件Primer 3设计，Shh基因序列上游引物Shh－F：GGGTTCGGGAAGAGGAGGCA，下游引物 Shh－R：TCGGTCACCCGCAGTTTCA，扩增条带293bp。ShhDNA片段PCR扩增和鉴定委托上海GENECHEM公司完成。

1.2 PTC细胞转染 分为两组：实验组（转染慢病毒pGC－FU－Shh－GFP表达载体）；阴性对照组（转染空载体慢病毒阴性对照载体）。转染前1d将生长状态良好的PTC细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔接种5×105个细胞，随后按慢病毒转染细胞步骤进行。取慢病毒转染效率在80%以上的目的细胞进行实验。

1.3 MTT试验 调整PTC细胞密度为1×107个／L。铺4个96孔板，每孔2000个细胞。待细胞贴壁后，取0h、24h、48h、72h后的样品，每孔加入10μl MTT溶液，继续孵育4h。在490nm波长处测定吸光度（OD值）。以OD值为纵坐标，时间点为横坐标，绘制两组细胞的生长曲线，对比两组细胞的生长情况。

1.4 检测细胞周期 分别收集Shh－PTC细胞与阴性对照组细胞，离心、洗涤重复2次后加入1ml的4℃预冷后的70%乙醇固定，经流式细胞仪检测分析，得出细胞周期各时相的比例。

1.5 Transwell细胞迁移实验 用孔径8μm聚碳酸酯膜的Transwell小室，调整PTC细胞密度为1×107个／L。按迁移实验步骤进行。显微镜下取15个视野，观察计算平均数。

1.6 转染前后Shh通路相关基因表达检测 根据GenBank中人SMO基因序列（NM＿005631.4），Gli1基因序列（NM＿0001160045.1）及PTCH基因序列（NM＿000264.3）设计引物并合成。按 mRNA及蛋白检测步骤，对PTC细胞在转染前后SMO、Gli1、PTCH mRNA及蛋白表达进行检测。

1.7 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行分析，采用χ2检验进行显著性分析，以P＜0.05为有统计学意义，P＜0.01为有十分显著的统计学意义，P＞0.05为无统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒载体转染PTC细胞的效率 按转染慢病毒载体与细胞数量比值MOI＝20转染人PTC细胞48h、96h后，分别观察可见强绿色荧光颗粒，转染效率约为80%，细胞生长状态良好，表明转染条件稳定，细胞转染成功，可以用于后续的实验。

2.2 Shh对PTC细胞增殖的影响 MTT法检测细胞的密度（OD）值绘制细胞的生长曲线，结果显示实验组生长曲线陡直，细胞生长速度较阴性对照组显著提高（P＜0.05），提示Shh的过表达有潜在促进PTC细胞增殖的作用。见图1。

图1 各组细胞不同时间的生长曲线

流式细胞检测细胞周期发现：与阴性对照组细胞相比，Shh－PTC细胞24h后S期上升至20.88%；Shh－PTC细胞48h后G1期上升至83.78%，结果提示：Shh－PTC组G1、S期相对阴性对照组增高，转染Shh基因后的PTC细胞增殖较快。

2.3 Shh对PTC细胞迁移的影响 迁移至下室的细胞数目在实验组15个视野共511个细胞，每个高倍镜（400×）视野平均34个细胞；阴性对照组15个视野共323个细胞，每个高倍镜（400×）视野平均22个细胞，见图2。两者差异具有统计学意义（P＜0.05）。与阴性对照组比较，实验组穿透滤过膜细胞数量明显增加。结果提示过表达Shh明显增强人PTC细胞的迁移运动能力。

2.4 转染后两组细胞Shh mRNA和Shh蛋白的表达水平

Realtime－PCR检测细胞中Shh mRNA的表达，实验组PTC细胞Shh mRNA表达水明显高于阴性对照组（P＜0.05），提示慢病毒pGC－FU－Shh－GFP表达载体对PTC细胞的Shh基因过表达有效。见图3。

Western blotting检测实验组PTC细胞Shh蛋白的表达水平明显高于阴性对照组（P＜0.05），提示慢病毒pGC－FU－Shh－GFP表达载体转染PTC细胞后，Shh蛋白的表达增多，与Realtime－PCR结果一致。

图2 细胞的迁移活力（400×）

图3 FQ－PCR（2－△△Ct方法）检测两组细胞Shh mRNA的相对表达量

2.5 转染后Sonic hedgehog通路相关的基因SMO、Gli1、PTCH蛋白表达水平明显提高。Western blotting检测结果显示，与阴性对照组相比过表达Shh基因的PTC细胞SMO、Gli1、PTCH 3种蛋白的表达都有所升高，实验组SMO表达是阴性对照的1.154倍，Gli1是阴性对照组的1.062倍，PTCH是阴性对照组的1.205倍。见图4。

图4 Sonic hedgehog通路相关蛋白表达变化

3 讨论

Shh蛋白属于分泌型信号蛋白，作为Sonic hedgehog信号通路的启动信号，通路过程将信号转导至细胞内，转录因子Gli蛋白家族激活下游靶基因，使细胞发生一系列病理、生化等方面变化。研究结果，Sonic hedgehog信号通路途径的反常在恶性肿瘤的生长和维持中起到重要作用。本研究采用慢病毒载体pGC－FU－Shh－GFP转染PTC细胞，稳定过表达Shh蛋白，观察Shh稳定过表达后PTC细胞生物学性状的变化。结果显示，Shh稳定过表达后，PTC细胞表现出了较强的细胞增殖能力，使细胞周期G1期上升，提示Shh可能在PTC中参与了其增殖过程。细胞迁移实验结果提示过表达Shh明显增强人PTC细胞的迁移运动能力，初步提示Shh可能参与了PTC转移的过程。Shh过表达后，Sonic hedgehog信号通路中关键基因SMO、Gli1、PTCH mRNA和蛋白表达水平均明显提高，验证了PTC细胞该传导通路激活过程，符合以往的文献报道。目前研究对于信号增强后变异细胞的鉴别，对于该信号蛋白如何调节肿瘤恶性，尤其对Gli蛋白家族的下游靶基因研究较少，也是我们亟待解决的问题。

本研究证实在PTC的发生、发展中Sonic hedgehog通路激活是激发或促进因素，可能促进肿瘤细胞的生长、转移。Shh可能为PTC预后判断指标及潜在的治疗靶点，尤其可能在进展期PTC患者治疗中起到作用。推测Shh缺乏胆固醇修饰，可能会抑制远程信号传递作用；作用靶点为SMO蛋白的信号通路小分子抑制剂环王巴明，可能在进展期PTC患者治疗中起到作用。

[1]Kasper M，Regl G，Frischauf AM，et al.GLI transcription factors：mediators of oncogenic hedgehog signaling[J].Euro J Cancer，2006，42（4）：437.

[2]Rubin LL，De Sauvage FJ.Targeting the Hedgehog pathway in cancer[J].Nature，2006，5（12）：1026.

[3]江 稳，陈锡林，丁 咏，等.Hedgehog信号传导通路相关基因在肿瘤组织中的表达及其特异性抑制剂Cyclopamine对增殖、凋亡的影响[J].中华实验外科杂志，2010，27（5）：651.

[4]Nelson KK，Gattuso P，Xu X，et al.Expression of the Sonic Hedgehog pathway molecules in synchronous follicular adenoma and papillary carcinoma of the thyroid gland in predicting malignancy[J].Central Surgical Association，2010，148（4）：654.

[5]边学海，张 广，张纯海，等.甲状腺乳头状癌组织中Shh和Gli1的表达及其临床意义研究[J].国际外科学杂志，2011，38（2）：78.

[6]边学海，赵吉生，徐为然，等.人Shh基因重组过表达慢病毒载体的构建与鉴定[J].中国实验诊断学，2013，17（11）：1970.

[7]边学海，赵吉生，张秀英，等.人甲状腺乳头状癌原代细胞的体外长期培养[J].中国普外基础与临床杂志，2011，18（8）：840.