谷氨酰半胱氨酸连接酶活性在系统性红斑狼疮中的变化及意义

原江水，张宗亮，宋卫青＊

（1.青岛市市立医院 检验科，山东 青岛266011；2.青岛市市立医院 泌尿外科，山东 青岛266011）

系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE）是一种多器官、多系统的具有复杂临床症状的自身免疫性疾病，是以多克隆B细胞高度增生活化和多种自身抗体生成为特点的自身免疫病[1]。谷胱甘肽（GSH）是机体中重要的抗氧化和自由基清除剂，保护细胞免受活性氧的损害，当细胞受到氧化和其他各种应激情况时，GSH生物合成的增加对于保持细胞的氧化还原状态具有十分重要的作用。已有研究证明，活性氧产物在自身免疫性疾病的发病和病情进展过程中发挥十分重要的作用，氧自由基等氧化应激因素导致自身免疫性疾病发生过程中细胞内谷胱甘肽含量的降低。谷氨酪－L－半胱氨酸连接酶（GCL），是GSH从头合成过程第一步反应的催化酶，也是GSH从头合成的限速酶。GCL的表达可以受到很多种因素的调节，例如GSH的耗尽、活性氧的产生、细胞因子和激素等[2]。研究发现，组织中GCL的活性降低与GSH水平的下降具有很好的相关性[3]。尽管SLE的发病和GSH的含量存在一定的关系，但是在SLE患者的免疫细胞中GCL活性的研究较少，本文拟对SLE患者外周血淋巴细胞中的GCL活性进行研究，探讨GCL活性在SLE发病过程中的变化和意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 30例SLE患者来自青岛市市立医院门诊及住院的活动期患者，符合美国风湿病学会SLE诊断标准中的4项或4项以上，其中男性6例，女性24例，年龄21岁－57岁，平均34.7岁，其中SLE患者中合并狼疮肾炎者18例；正常对照30例，系我院健康体检者，排除1型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等疾病，其中男性7例，女性23例，年龄22岁－60岁，平均35.5岁。

1.1.2 主要仪器和试剂 Ficoll Paque淋巴细胞分层液购自上海恒信公司，BCA检测试剂盒购自Beyotime公司，GENios Plus酶标仪（瑞士Tecan公司）。

1.2 方法

1.2.1 外周血淋巴细胞的分离 采集SLE患者及对照组的外周血2ml于肝素钠抗凝管，将PBS稀释后的血液缓慢加于2ml淋巴细胞分层液液面上，2 000g离心15min，吸取淋巴细胞层于另一离心管中，加入PBS混匀后，2 000g离心15min，洗涤细胞2次。

1.2.2 GCL 活性的分析 根据 Chen等[4]2010年的GCL活性分析进行检测，使用TES／SB缓冲液调整细胞密度为5×107／L，100W超声波处理60秒，于4℃下10 000g离心10min，收集上清液于4℃下15 000g离心20min，收集上清液使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，具体操作步骤按说明书，调整蛋白浓度为1mg／ml。取上清液30μl与GCL反应液30μl充分混合，37℃孵育5min。将30μL的30mM的半胱氨酸溶液加入上述混合物中，37℃孵育10min，加入200mM SSA 30μl终止酶反应，冰上放置20min后，置于离心机中2 000 g，4℃离心10min，取20μL离心后的上清液分别加入96孔板中，然后在96孔板上加入5μl的GCL反应液，5μl的200mM SSA，5μl的 H2O和5μl不同浓度的γ－GC标准溶液（0，20，40，60，80，100，120，140μM），样品孔和标准品孔每孔均加入180 μl的NDA，室温避光孵育30min，将96孔板置于酶标仪中使用472nm excitation／528nm emission进行分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计学软件进行分析，两组之间比较采用t检验，以P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 SLE患者和对照组GCL活性检测结果 来自30例SLE患者外周血淋巴细胞的GCL平均活性水平为266.10±13.31mmol／min／mg蛋白浓度，而对照组的GCL平均活性水平为383.27±18.68 mmol／min／mg蛋白浓度，与对照组相比较，SLE组其GCL活性明显下降（P＜0.001），见图1。

2.2 合并狼疮肾炎的SLE患者和未合并狼疮肾炎的SLE患者的GCL活性检测结果比较 合并狼疮肾炎的SLE患者的外周血淋巴细胞的GCL平均活性水平为229.64±17.82mmol／min／mg蛋白浓度，而未合并狼疮肾炎的SLE患者的外周血淋巴细胞的GCL平均活性水平为303.25±18.47mmol／min／mg蛋白浓度，两组相比较合并狼疮肾炎的SLE患者的GCL活性显著减低（P＜0.009），见图2。

图2 合并和未合并狼疮肾炎的SLE患者GCL活性

3 讨论

系统性红斑狼疮（SLE）是一种多器官、多系统的复杂自身免疫性疾病，以自身抗体的产生和免疫复合物的聚集为特征[5]。在自身免疫性疾病的发生发展过程中，自由基等氧化应激因素发挥了十分重要的作用。抗氧化应激作用的减弱被认为是SLE发病过程中的重要因素。氧化还原系统的失衡可能导致SLE发病过程中免疫功能缺陷、自身抗体产生和程序性细胞死亡过程的损害[6]。

本文通过对SLE患者外周血淋巴细胞中GCL活性进行检测分析，结果发现与正常对照组相比较，SLE患者中GCL活性明显降低，另外，我们还对合并狼疮肾炎和未合并狼疮肾炎的SLE患者的外周血淋巴细胞中的GCL活性进行了分析比较，发现合并狼疮肾炎的SLE患者其外周血淋巴细胞的GCL活性降低的更为明显。

GCL是GSH从头合成过程第一步反应的催化酶，也是GSH从头合成的限速酶。大量的研究显示GCL活性的增加能够使细胞内GSH的含量增加[7]。通过本研究结果发现，GCL活性在SLE患者中明显下降，说明氧化应激因素参与了SLE的发病过程，而合并狼疮肾炎的SLE患者中的GCL活性下降尤为明显，说明GCL的活性水平可能与疾病的严重程度存在一定的相关性。

GCL活性水平的下降导致GSH含量的不足，而GSH含量不足可能通过几个方面的机制影响SLE的发病过程，其中一个是减低的GSH含量影响caspase和转录因子的激活，影响Bcl－2的表达和功能以及硫氧还系统的功能，而这些均在凋亡的早期过程中发挥着重要的作用。另有研究显示抗原提呈细胞中GSH含量的降低抑制Th1型细胞因子IFN－γ和IL－12的产生并且促进Th2型体液免疫应答的发生[8，9]。

综上所述，GCL活性水平的下降导致GSH含量的不足在SLE患者的发病过程中发挥着一定的作用，但是其内在作用机制还需要进一步的研究，以便为SLE的预防、诊断和治疗提供帮助。

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