利用大鼠制备去窦弓神经的方法及其效应的研究

姜 宪，兰 艳，杨艳召，李丽威，卢焕俊，李香兰，金元哲＊

（1.延边大学附属医院 耳鼻咽喉科；2.延边大学医学院生理学与病理生理学教研部，长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室（延边大学），吉林 延吉133002）

众所周知压力感受性反射是哺乳动物调节血压最重要的神经调节机制。颈动脉窦和主动脉弓上的感受器将传入冲动分别经窦神经和主动脉神经投射到孤束核，并与延髓和脑干的各种心血管活动有关的神经元发生联系，快速的调节交感和副交感神经的张力，保证机体血压相对稳定。Krieger等[1]于1964年最初在研究神经源性高血压模型时，曾用过切断压力感受性反射传入神经的方法。但是到了1981年有人[6]利用清醒动物24h连续监测血压后发现，这种动物平均血压水平并未升高，只是血压不稳定性加大。近期许多学者提出，压力感受性反射敏感性是鉴定血压影响心率的重要指标，可以反映机体调节体循环血压的功能状态[8]。刘伟也曾报到，5种去窦弓神经对清醒大鼠压力感受性反射敏感性的影响[9]。但是，大鼠的窦弓神经走行变异比较大，尤其是主动脉神经在大鼠单独走行率较低，术后动物生存率也不高。关于怎样去除小动物窦弓神经，尚无详细的介绍。本文较为详细地介绍了清醒状态下，利用大鼠制备破坏窦弓神经的方法，并观察了这种处理对压力感受性反射敏感性的影响，为利用小动物研究窦弓反射在心血管功能调节机制提供可靠的实验方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

实验选用体重在250±30g的SD系雄性清洁级大鼠共24只（购自吉林大学白求恩医学部实验动物中心。许可证号码：SCXK（吉）－2011－0004）。动物随机分成正常组（Normal group）、假手术组（Sham group，SHAM）、压力感受器破坏组（Sinoaortic denervation，SAD），每组8只。为了避免麻醉对动物神经系统和心理行为学的影响，所有实验动物均在清醒状态下观察各项指标。动物饲养室温度维持在18－26℃，实验前适应性喂养3天。本研究严格依照国家实验动物管理条例及实施细则进行实验操作。

1.2 破坏窦弓反射动物模型制备

用10%水合氯醛（300mg／kg）腹腔注射麻醉，动物仰卧位固定。颈部备皮，碘伏消毒、酒精脱碘后，在颈前部“U”形切开皮肤。分离颌下腺，缝合固定于两侧口角，牵拉下颌角，分离颈动脉三角区肌肉及筋膜。解剖显微镜下小心暴漏颈内外动脉分叉处，即可见从头侧向内斜上行汇入到舌下神经的1－3条纤细的窦神经，分离切断，并用四氯化碳棉球缠绕颈动脉窦约2min腐蚀损伤可能残存的窦神经分支（为防止损伤在周边上行的其他神经，周围用干棉球保护）。SD大鼠主动脉神经自主动脉弓处发出后，位于颈主动脉鞘后方，迷走神经内侧，非常纤细。切断肩胛舌骨肌，钝性剥离鞘前静脉，切开颈动脉鞘后，向内侧牵拉颈主动脉，在汇入喉上神经处切断主动脉神经，然后逐层缝合。

1.3 血压与心率测定

腹腔注射10%水合氯醛（300mg／kg）麻醉，显微镜下在腹股沟区分离股动静脉，经股动脉插入灌有肝素钠溶液的导管至腹主动脉，经股静脉插入灌有生理盐水的聚乙烯管至下腔静脉。用穿皮针分离皮下组织后，经腹股沟、后背穿至头顶，剪出一个小口，把动静脉导管的一端拉出，缠绕胶布固定。测定开始前解开动静脉导管，动脉与RM－6240生物记录系统（成都仪器厂）连接，测平均血压（mean arterial pressure，MAP）及心率（hart rate，HR）。静脉插管用于注射苯肾上腺素（15μg／kg 3min）或硝普钠（15 μg／kg 3min）诱发压力感受性反射。

1.4 数据处理

参照Smyth[5]方法，采用静脉注射苯肾上腺素或硝普纳诱发压力感受性反射后，测定用药前后的心率与平均动脉压的变化值之比（ΔHR／ΔMAP＝HRafter－HRbefor／MAPafter－MAPbefor，bpm／mmHg）作为压力感受性反射敏感性指标。

所有数据均用SPSS11.5统计软件处理，并用Mean±SD表示。统计学处理采用单因素方差分析，以P＜0.05定为有显著性差异。

2 实验结果

2.1 窦弓神经走行特点及去窦弓神经后动物的一般状态

本实验用24只SD系大鼠观察了窦神经和主动脉神经的走行特点。发现该系大鼠窦神经，在颈内动脉分叉处起点膨大部分向内斜上行汇入到舌下神经，其走行比较单一，容易区分。但是主动脉神经的走行有较大的变异，在所观察的24只动物中有17只动物在颈部单独走行，约占70%。切开颈动脉鞘后把迷走神经轻轻向外牵拉，就会看到非常细的主动脉神经，在迷走神经和颈交感神经之间并行，并汇入喉上神经、迷走神经后投向中枢（图1）。其余动物均无法单独辨别主动脉神经。

动物在水合氯醛麻醉下，切除主动脉神经和窦神经后，大约过1.5h即可从麻醉中醒来。待术后24h时动物精神萎靡、反应迟钝，而且受刺激时易怒及烦躁。去窦弓神经后动物的死亡率较高，在实验的早期死亡率约为50%。但是在后期的实验中，利用单独饲养，严格控制室温在25℃上下2℃左右、湿度60%，避免各种噪声刺激后，动物的生存率提高到75%左右。

2.2 苯肾上腺素和硝普钠对正常动物血压和心率的影响

图1 大鼠左侧颈部血管和神经走行模式图

正常动物股静脉注射生理盐水对血压和心率无明显影响，但是苯肾上腺素（PE，15μg／kg 3min）和硝普钠（SNP，15μg／kg 3min）却使血压和心率的变化非常明显。由图2可见，PE使血压急剧升高，约在1min时达到高峰，平均由对照值的97.6±6.10mmHg 升高到 127.34±7.34mmHg（P＜0.01），4min时基本恢复到正常状态。与此同时，心率显著下降，平均由409.22±5.69beat／min下降到327.67±10.45beat／min（P＜0.01）。静脉注射SNP后，血压明显下降，而心率则显著加快，分别由基础状态的105.30±3.75mmHg和415.72±3.34beat／min，变成70.87±3.50mmHg和459.83±5.83beat／min，组间比较P值均小于0.01（图2，3。表1）。

图2 静脉注射PE和SNP对正常动物动脉平均血压的影响

图3 正常动物静脉注射苯肾上腺素和硝普钠对心率的影响

另外，还对比观察了PE和SNP对压力感受性反射敏感性的影响。发现正常动物使用PE时伴随着短时间内血压迅速增高，心率快速下降；而使用SNP时随着血压的下降，心率相应加快，压力感受性反射敏感性始终处于相对稳定水平。

2.3 去窦弓神经对压力感受性反射敏感性的影响

去窦弓神经后PE和SNP同样能够导致动物的血压和心率的显著变化。注射PE后血压由对照值的94.77±2.79mmHg升高到130.71±4.87 mmHg（P＜0.01），而SNP则使血压由对照值的104.04±2.26mmHg下降到69.05±3.81mmHg（P＜0.01），而且各组间其变化幅度相差无异，组间比较差异无统计学意义（P＞0.05，见表1）。与血压的变化不同，注射PE和SNP后使去窦弓神经动物的心率变化明显减小甚至发生相反的变化。静脉注射PE心率不下降，反而加快，由对照值的420.86±7.59加快到506.50±9.45beat／min，与其他两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。静脉注射SNP后心率虽加快，但幅度明显降低，由对照值的422.17±7.50加快到428.00±7.95（P＜0.05），与正常组和假手术组相比差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表1 不同组使用药物时血压的变化（mmHg）

表2 不同组使用药物时心率的变化（beat／min）

2.4 去窦弓神经对压力感受性反射敏感性的影响

静脉注射PE时压力感受性反射的敏感性在正常组和假手术组均表现为负值（分别是－2.77±0.76和－2.74±0.43）。但是同时摘除窦神经和主动脉神经后，却反转成正值（2.48±0.59）。静脉注射硝普钠后压力感受性反射敏感性由正常组和假手术组的－1.2±0.14及－1.2±0.13，下降到－0.18±0.03。以上可以看出SD大鼠压力感受器传入神经切断后，压力感受器敏感性明显减弱，与正常组及假手术组比较，有明显的统计学差异P＜0.05（见表4、5）。提示SD大鼠的窦神经和主动脉神经破坏成功，可作为压力感受器破坏模型。

图4 股静脉注射PE对压力感受性反射敏感性的影响

3 讨论

图5 静脉注射SNP对压力感受性反射敏感性的影响

压力感受性反射在心排出量、外周阻力、血量等发生突然变化的情况下，对动脉血压进行快速调节的过程中起着重要的作用，使动脉血压不至发生过分的波动。压力感受性反射的感受器位于双侧颈动脉窦和主动脉弓，其传入神经分别经窦神经和主动脉神经传入到延髓的孤束核。孤束核位于延髓背侧、包绕于孤束周围的“Y”形柱状核团，是延髓唯一接受血压、心率和循环血量改变的传入信号的感觉核[2]。已有研究表明在一定范围内，压力感受器传入冲动频率与动脉管壁被动扩张程度成正比，在同一血压水平对脉动性压力刺激比持续性压力刺激更敏感[10]，使机体在各种内外环境的变化中维持体循环血压的相对稳定。

本实验利用SD系大鼠制备了去窦弓反射模型。因为窦神经及主动脉神经很纤细，并与迷走神经、舌下神经、喉上神经、喉返神经、交感神经干及颈部大血管密切相邻[4]，假如术中发生损伤，术后大鼠死亡率较高，故明确及掌握大鼠颈部解剖是模型制作成功的关键。SD系大鼠的窦神经位于下颌下二腹肌后腹与颈动脉分叉所形成的颈动脉三角内。牵开二腹肌后腹就可看到与二腹肌相平行的舌下神经，剥开颈动脉鞘暴露颈动脉交叉处，小心清理分叉处软组织，梳理颈内、外动脉，就可看到来源于颈动脉窦的从后下向前上走行加入舌下神经的窦神经[3]。据文献报导[11]窦神经有1～数条，但我们操作中没有见到1条以上的窦神经。但为了确保去神经完整，术中彻底清理颈动脉窦周围软组织，并用纤细的石碳酸棉球包裹颈动脉窦约2min，腐蚀及破坏神经。主动脉神经来源于主动脉弓压力感受器，在颈部与两侧颈总动脉相并行，加入迷走神经在颈部的第一分支喉上神经。牵开或切断肩胛舌骨肌，剥开颈动脉鞘，看到向后绕行于颈主动脉，并与之垂直走行的喉上神经，向内牵开颈总动脉，就可见到喉上神经进入迷走神经之前与迷走神经相平行并入喉上神经的非常纤细的主动脉神经。

颈动脉窦、主动脉弓压力感受性反射又称为减压反射，安静状态下窦神经和主动脉神经不断发出神经冲动，经孤束核作用于延髓腹外侧核，抑制心交感和交感缩血管中枢，使血压稳定在一定水平。压力感受性反射敏感性（baroreflex sensitiviry，BRS）是反应哺乳动物自主神经活动状态的指标，为了明确去窦弓反射模型制备是否成功，接着参照Smyth[5]的方法，观察了BRS。发现用α型肾上腺素能受体兴奋剂苯肾上腺素血压仍然明显升高，但心率不但不出现减慢反而加快，BRS表现正值。使用硝普钠后血压下降时，心率轻度加快，并且BRS明显受到抑制。证明制备去窦弓反射成功。

另外，实验中还发现，去窦弓反射的动物死亡率较高，约在50%左右。所以在制备模型后动物分笼饲养，精心照料是提高生存率的关键。

本试验所提供的动物模型，经济而实惠，为非窦弓反射性血压调控机制的研究提供重要的试验方法。

[1]Krieger EM.Neurogenic hypert ension in rat[J].Ci rc Res，1964，15：511.

[2]朱大年，樊小力.生理学[M].北京：人民卫生出版社，2010：465－459.

[3]Hong Zhu，James R.Jordan，et al.Linear acceleration－evoked cardivascular respones in awake rats[J].Appl physical，2007，103：646.

[4]R.K.W.Chan，E.V.Jarvina，et al.SAWCHENKO.Effects Of Selective Sinoaortic Denervations On Phenylephrine－Induced Activational Responses In The Nucleus of The Solitary Rat[J].Neuroscience，2000，101（1）：165.

[5]Smyth HS，Sleight P，Pickering GW.Reflex regulation of arterial pressure during sleep in man.A quantitative method of assessing baroreflex sensitivity[J].Cire es，1969，24（1）：109.

[6]Norman RA，Coleman TG，Dent AC.Continuous monitoring of arterial pressure indicates sinoaortic denervated rats are not hypertensive[J].Hyper tension，1981，3：119.

[7]Bertinieri G，Rienzo MD，Cavallazzi A，et al.Evaluation Of Baroreceptor Reflex By Blood Pressure Monitoring In Unanesthetized Cats[J].Am J Physiol，1988，254：377.

[8]Stefan H，Hohnl oser.Untersuchung Der Barrorezeptorenfunktion[J].Deutsch Medisin，2000，17：29.

[9]刘 卫，赵晓民，赵志春，等.5种选择性去窦弓神经方法对清醒大鼠动脉压力感受反射敏感性的影响[J].中国应用生理学杂志，2001，2：270.

[10]R.A.Dampney，Functional organization of central pathways regulating the cardiovascular system[J].Physiol Rev，1994，74：323.

[11]McDonald D.M.Morophology of the rat carotid sinus nerve.I.Course，connections，dimensions and ultrastructure[J].J Neurocytol，1983，12：345.