五味子乙素对巨噬细胞炎症相关介质表达的影响

胡中莲，孟祥辉

（1.长春市双阳区医院 妇产科，吉林 长春130600；2.吉林大学基础医学院，吉林 长春130021）

盆腔炎是是妇女的常见病、多发病之一，有时表现出慢性迁延、缠绵难愈，且复发率高。西医治疗主要使用抗生素，反复使用抗生素易产生耐药性，影响机体免疫功能，药物不良反应明显。近年来，随着将中药用于治疗盆腔炎，并获得较好的临床疗效。在这些用于治疗急慢性的中成药的方剂中有味药是五味子，五味子为木兰科植物五味子或华中五味子的干燥成熟果实，是著名的滋补性中药。随着现代化科技的发展和现代药理的研究，五味子的功效被渐渐的揭开，为中药走向世界打下坚实基础。目前研究证明，五味子的主要化学成分有木脂素，挥发油和多糖，其次还有有机酸，脂肪油等[1，2]。其中木脂素包括：五味子素、五味子甲素、五味子乙素等20多种成分[2]。关于五味子木脂素的化学成分及生物活性研究的报道很多，但目前关于五味子木脂素的抗炎作用机理的研究尚不清楚。因此本实验以中医药理论为指导，通过细胞法建立炎症细胞模型，应用酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）及分子生物学技术探讨五味子乙素的抗炎作用。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

健康雌性昆明种小鼠，体重17－22g（由吉林医药学院实验动物中心提供）；地塞米松磷酸钠注射液（吴中医药公司）；小牛血清（杭州四季清）；五味子乙素标准品（维克奇生物公司）；青链霉素混合液、IMDM、MTT、PBS、RNA 提取试剂盒、RT－PCR试剂盒及DNA－Marker（北京鼎国生物技术有限公司）；NO试剂盒（南京建成生物工程研究所）；小鼠IL－6、TNF－α检测试剂盒（RND分装）

1.2 巨噬细胞制备

取6－8w龄昆明小鼠5只，每只小鼠腹腔注射3%巯基乙醇酸钠1ml，饲养3d。第3d脱颈处死，75%酒精浸泡5 min后，无菌条件下，倒立小鼠并腹腔注入无血清IMDM培养液5ml，仰卧平放并轻轻揉腹部2min，用镊子稍提起腹腔，并用剪子剪开一个小口，用吸管轻轻吸取细胞悬液，移入离心管中，1 000rpm离心5min，弃去上清。用PBS充分洗涤2次，1 000rpm离心5min，弃去上清后显微镜下计数，用IMDM培养液（含10%小牛血清，青链霉素混合液）调整细胞至所需浓度2.5×105个／ml，接种于96孔板中，每孔100 μl，置于37℃，5%CO2培养箱中，培养24h后换液，去除未贴壁细胞，以备后续实验应用。

1.3 炎症细胞模型制备及分组

取一板已培养于96孔板的细胞，换液后，随机分为4组。Normal组：加入与实验组同体积的DMSO；DEX组：加1×10－7mmol／L地塞米松作为阳性对照；LPS组：单独加终浓度1.1×10－2mmol／L脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）；Schisandrin＋LPS组：根据给五味子乙素剂量不同分为4×10－5mmol／L组、4×10－6mmol／L组、4×10－7mmol／L组、4×10－8mmol／L组。各组3平行孔，培养24h。

1.4 RT－PCR检测IL－1β的表达

将各组细胞用0.25%的胰酶消化、离心，依照总RNA提取试剂盒的操作步骤，提取总RNA，取出1μl总RNA样品稀释100倍后，紫外分光光度计测定OD260和OD280，计算其浓度和纯度。另取出5μl总RNA样品用于琼脂糖凝胶电泳观察RNA的完整性。

从GeneBank中检出小鼠IL－1β基因cDNA序列（IL－1β：基因编号NM008361，cDNA大小为1 328bp）。选用看家基因β－actin作为内参照（β－actin：基因编号 NM007393，cDNA大小为1 891bp）。IL－1β的上游引物为5’－ctgaaagctctccacctc－3’，下游引物为5’－tgctgatgtaccagttgggg－3’。β－actin的上游引物为5’－gttaccaactgggacgaca－3’，下游引物为5’－aagcctcagggcatcg－3’。按照RT－PCR试剂盒步骤进行扩增。扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察、拍照，测定其电泳条带的灰度值。

1.5 ELISA测定巨噬细胞培养基中IL－6、TNF－α和 NO的含量

各组细胞37℃孵育24h后，收集培养基，并分别严格按照小鼠IL－6、TNF－α及NO定ELISA剂盒使用说明操作进行测定。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 五味子乙素对小鼠巨噬细胞中IL－1βmRNA表达的影响

Schisandrin组的巨噬细胞中IL－1βmRNA表达水平明显低于LPS组，DEX组巨噬细胞中IL－1βmRNA表达水平也明显低于LPS组，并且Schisandrin组巨噬中IL－1βmRNA表达明显低于DEX组（图1，表1）。

图1 IL－1β基因RT－PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳

表1 各组单核巨噬细胞中IL－1βmRNA表达水平比较（±s，n＝5）

表1 各组单核巨噬细胞中IL－1βmRNA表达水平比较（±s，n＝5）

＊compared with LPS group，P＜0.05；△compared with DEX group P＜0.05

5 1.012±0.031 DEX Group 5 0.640±0.019＊LPS Group 5 1.025±0.042 Schisandrin＋LPS Group 4×10－5 mmol／L 5 0.327±0.122＊△4×10－6 mmol／L 5 0.486±0.122＊△4×10－7 mmol／L 5 0.526±0.122＊4×10－8 mmol／L 5 0.587±0.122－actin Normal Group Group n IL－1β／β＊

2.2 五味子乙素对巨噬细胞分泌IL－6，TNF－α，NO的影响

Schisandrin＋LPS组巨噬细胞炎症模型上清液中的IL－6、TNF－α和NO含量明显低于LPS组和Normal组，经方差分析结果显示，随着五味子乙素作用效果呈剂量依赖性（表2）。

表2 五味子乙素对巨噬细胞分泌IL－6、TNF－α和NO的影响（±s，n＝5）

表2 五味子乙素对巨噬细胞分泌IL－6、TNF－α和NO的影响（±s，n＝5）

＊Compared with Normal group，P＜0.05

Group dose（μl） TNF－α（mmol／L） IL－6（mmol／L） NO（mmol／L）Normal Group 0.4 0.0426±0.0007 0.0726±0.0007 0.530±0.003 DEX Group 0.4 0.0252±0.0005＊ 0.0452±0.0005＊ 0.262±0.003＊LPS Group 0.4 0.0419±0.0005 0.0719±0.0005 0.512±0.004 Schisandrin＋LPS Group 4×10－5 mmol／L 0.4 0.0216±0.0003＊ 0.0366±0.0003＊ 0.211±0.005＊4×10－6 mmol／L 0.4 0.0246±0.0002＊ 0.0386±0.0002＊ 0.240±0.003＊4×10－7 mmol／L 0.4 0.0372±0.0002＊ 0.0672±0.0002＊ 0.402±0.006＊4×10－8 mmol／L 0.4 0.0385±0.0002＊ 0.0685±0.0002＊ 0.461±0.004＊

3 讨论

炎症反应是人体疾病发生发展的重要因素，许多妇科疾病均与炎症反应有关。巨噬细胞在炎症中的地位尤为重要，活化的巨噬细胞通过分泌多种趋化因子，诱导更多的巨噬细胞活化、募集并产生白介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）、IL－6和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor－α）等多种促炎因子[3]，从而加强局部的炎症反应，因此巨噬细胞所分泌炎性因子的水平可以用来检测药物抗炎作用的一个重要指标。基于此，我们利用细菌表面高度保守分子LPS来刺激巨噬细胞[4]，研究五味子乙素对于LPS诱发的巨噬细胞炎症模型中炎性因子表达和含量的影响。实验结果显示，给予五味子乙素处理巨噬细胞炎症模型，巨噬细胞中IL－1βmRNA的表达降低，同时也观察到巨噬细胞分泌IL－1量降低，提示五味子乙素具有抗炎作用。

TNF－a是炎症反应早期最重要细胞因子之一，是一种有活化的巨噬细胞分泌的促炎症因子，具有活化内皮细胞、中性粒细胞等作用，是导致炎性介质级联反应的始发因子。在炎症过程中TNF－α在局部组织中出现较早，并迅速达到高峰，从而诱发“次级”细胞因子如IL－6、IL－1β等的生成，是激活细胞因子级联反应主要介质，增强中性粒细胞的吞噬活性，合成和释放IL－6、IL－1、IL－8等[5]。巨噬细胞经过 LPS刺激后，分泌TNF－a增高，给予五味子乙素后TNF－a分泌量降低。同时也观察到NO的分泌量也有相似趋势。

NO具有细胞内和细胞间信使以及神经递质作用的信息分子，参与很多病理和生理的过程。而过多NO通常伴随免疫紊乱和炎症等[6]，NO的生物合成是在一氧化氮合酶（NOS）催化和辅助因子存在下由L－精氨酸与氧分子反应而来。诱导型NOS（iNOS）在静息细胞内是不表达的，当细胞受到细胞因子，其它微生物或免疫刺激下，iNOS表达才能增加并产生大量NO引起炎症反应[7]。NO是一种重要免疫分子和炎症介质，在炎症发展中具有双重作用，一方面通过刺激巨噬细胞诱导受感染细胞死亡和炎症，起到对抗外源性微生物的细胞毒作用，另一方通过促进周边非损伤细胞毒性或细胞炎症，加剧脓毒症，自身免疫或超敏反应的组织损伤[8]。

综上所述，在炎症反应过程中NO和TNF－α的增加可以诱发IL－6、IL－1β等炎性因子的生成，五味子乙素可通过IL－1β、TNF－α、IL－6、NO表达的抑制发挥其抗炎的作用，为进一步开发五味子乙素这种抗炎中药制剂提供理论依据。

[1]Zeng KW，Zhang T，Fu H，et al.Schisandrin B exerts anti－neuroinflammatory activity by inhibiting the Toll－like receptor 4－dependent MyD88／IKK／NF－κB signaling pathway in lipopolysaccharide－induced microglia[J].Eur J Pharmacol，2012，692（1－3）：29.

[2]Tang J，Shao B，Liu Y，et al.Highly sensitive determination of Schisandrin and Schisandrin B in plasma of rats after administration of Wurenchun （Fructus Schisandrae Chinensis Extracts）preparations by LC－ESI－MS／MS[J].Biomed Chromatogr，2010，24（6）：675.

[3]Jayaraman P，Sada－Ovalle I，Nishimura T，et al.IL－1βpromotes antimicrobial immunity in macrophages by regulating TNFR signaling and caspase－3activation[J].J Immunol，2013，190（8）：4196.

[4]Chelvarajan RL，Liu Y，Popa D，et al.Molecular basis of age－associated cytokine dysregulation in LPS－stimulated macrophages[J].J Leukoc Biol，2006，79（6）：1314.

[5]Mori T，Miyamoto T，Yoshida H，et al.IL－1βand TNFα－initiated IL－6－STAT3pathway is critical in mediating inflammatory cytokines and RANKL expression in inflammatory arthritis[J].Int Immunol，2011，23（11）：701.

[6]Crowell，Steele VE，Sigman CC，et al.Is inducible nitric oxide synthase a target for chemoprevention[J].Mol Cancer Ther，2003，2（8）：815.

[7]Panaro MA，Brandonisio O，Acquafredda A，et al.Evidences for iNOS expression and nitric oxide production in the human macrophages[J].Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord，2003，3（30）：210.

[8]Ana LV，Margarida GM.Teresa C，et al.Dexamethasone prevents granulocyte／macrophage colony stimulating factor－induced nuclear factor－kB activation，inducible nitric oxide synthase expression and nitric oxide production in a skin dendritic cell line[J].Mediators Inflamm，2003，12（2）：71.