两种不同免疫抑制方案对肾移植受者免疫状态的影响

房爱芳，张淦，李永海，向莹，明长生，张伟杰(华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所，教育部/卫生和计划生育委员会器官移植重点实验室，湖北 武汉100039)

临床上肾移植术后，维持期免疫抑制治疗目前仍然是以钙调磷酸酶抑制剂(CNIs)、吗替麦考酚酯(MMF)、激素的三联免疫抑制方案为主。CNIs的应用大大降低了急性排斥反应的发生，提高了移植受者的近期生存率，但因其肾毒性导致的移植肾慢性失功[1-2]、心血管疾病以及恶性肿瘤发生率的增高[3]，使其长期生存率的进一步提高受到限制。寻找有利于移植物长期存活的免疫抑制方案仍是移植界面临的主要难题之一[4]。

西罗莫司(SRL)是一种作用机制与CNIs完全不同的免疫抑制剂，具有低肾毒性[5]、抗细胞增殖、抗肿瘤[6]的特点，尤其是SRL具有诱导和维持外周免疫耐受的潜能[7-9]，因而以SRL为基础的免疫抑制方案亦深受瞩目。以前的研究大都聚焦于SRL和他克莫司(TAC)对调节性T细胞(Treg)的影响[10-11]，但长期应用SRL和TAC对受者调节性B细胞(Breg)的数量以及对供者特异性反应性的影响并未见报道。为此，本研究选择亲属活体肾移植后分别应用以TAC及SRL为基础方案的受者为研究对象，通过检测受者外周血Treg、Breg的比例，以及受者淋巴细胞经供者抗原刺激后分泌辅助性T细胞(Th1、Th2)的情况来探讨两种不同免疫抑制方案对肾移植受者免疫状态的影响。

1 资料和方法

1.1 研究对象

纳入2008年至2011年间亲属活体肾移植受者18例，手术前经过医院伦理委员会审批。18例受者均为初次移植，未使用免疫诱导治疗。全部病例目前肾功能稳定，根据应用免疫抑制方案的不同分为两组，SRL组应用SRL+MMF+泼尼松(Pred)方案；TAC组应用TAC+MMF+Pred方案，用药时间均超过1年；其中SRL组8例，TAC组10例，两组在终末期肾病病因、术前群体反应性抗体(PRA)水平、供受者年龄、人类白细胞抗原(HLA)匹配位点数、热缺血时间、冷缺血时间等方面差异均无统计学意义(表1)。相应的亲属活体肾移植的供者作为各组的空白对照。

表1 两组受者的基本资料

1.2 主要试剂

人淋巴细胞分离液，购自达科为生物技术有限公司；异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人CD4，别藻蓝蛋白(APC) 标记的抗人CD25，藻红蛋白(PE)标记的抗人叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)及配套的破膜固定剂，APC标记的抗人CD19，FITC标记的抗人CD5，PE标记的抗人CD1d，人γ-干扰素(IFN-γ)酶联斑点免疫试验(ELISPOT)试剂盒，人白细胞介素-10(IL-10)ELISPOT试剂盒，均购自美国eBiosciences公司。

1.3 研究方法

1.3.1人外周血单个核细胞分离

抽取肾移植受者及其供者静脉血，用磷酸盐缓冲液(PBS)等体积稀释，倾斜加入到与稀释血等体积的人淋巴细胞分离液表面，室温、1 800 r/min离心半径18 cm，离心30分钟，轻轻吸取云雾状淋巴细胞层，然后充分清洗，获取外周血单个核细胞。

1.3.2流式细胞术检测外周血Treg

将分离出的单个核细胞用流式buffer洗2遍，调整细胞浓度为1×106个/ml，加入FITC标记的抗人CD4、APC标记的抗人CD25进行细胞表面染色，经过破膜固定处理后加入PE标记的抗人Foxp3进行细胞内染色，具体操作均参照试剂说明书执行。上机检测，以阴性对照和同型对照设门参数，检测CD4+CD25+Foxp3+Treg。

1.3.3流式细胞术检测外周血Breg

将外周血单个核细胞制备细胞悬液，终浓度为1×106个/ml，加入APC标记的抗人CD19，FITC标记的抗人CD5，PE标记的抗人CD1d进行细胞表面染色，上机检测。

1.3.4ELISPOT检测受者对供者的特异性反应性

为探讨受者对供者的特异性免疫状态，取供者的淋巴细胞作为刺激细胞，相应受者的淋巴细胞作为反应细胞，行混合淋巴细胞培养。采用ELISPOT检测培养液中分泌Th1型 (IFN-γ)、Th2型 (IL-10)细胞因子的频数，以此判断受者的供者特异性反应性。Th1型及Th2型细胞因子分别选取IFN-γ和IL-10为代表。

1.3.4.1ELISPOT检测分泌IFN-γ的细胞频数

分别分离供、受者的淋巴细胞，其中供者的淋巴细胞作为刺激细胞，丝裂霉素C灭活(终浓度25 mg/L，37℃，水浴，30分钟)，受者的淋巴细胞作为反应细胞，调整细胞浓度为1×106个/ml，按1：1的比例加入已包被好的96孔板，具体操作按照人IFN-γ ELISPOT试剂盒标准操作流程进行，设置阴性对照、阳性对照，每组2个复孔，ELISPOT读数仪计数斑点数，经供者淋巴细胞刺激后分泌IFN-γ的细胞频数＝实验孔细胞频数－阴性对照细胞频数。

1.3.4.2ELISPOT检测分泌IL-10的细胞频数

方法和步骤同上，具体操作按照人IL-10 ELISPOT试剂盒标准操作，ELISPOT读数仪计数斑点数，计算分泌IL-10的细胞频数。

1.4 统计学方法

采用GraphPad Prism 6统计软件，本实验数据均以均数±标准差(x±s)表示，组间均数两两比较进行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 流式细胞仪检测Treg结果

SRL组肾移植受者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg占总CD4+T细胞的(6.68±0.42)%，TAC组为(3.59±0.47)%，空白对照组为(6.59±0.36)%，SRL组和空白对照组显著高于TAC组 (均P＜0.05)，SRL与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见图1。

2.2 流式细胞仪检测Breg结果

SRL组外周血Breg(CD19+CD5+CD1d+) 占CD19+B细胞的比例为(16.43±3.56)%，TAC组为(13.09±1.64)%，空白对照组为(16.58±1.31)%，3组之间两两比较差异均无统计学意义(均P＞0.05)。见图 2。

2.3 ELISPOT检测特异性细胞因子的分泌

ELISPOT检测SRL组分泌特异性细胞因子IFN-γ的细胞频数为(117.00±21.54)/ 500 000、TAC组 为(126.00±24.08)/ 500 000；SRL组 和TAC组分泌特异性细胞因子IL-10的细胞频数分别为(347.00±55.29)/ 500 000、(249.00±58.97)/500 000，两组比较差异均无统计学意义(均P＞0.05)，见图 3。

3 讨 论

SRL与TAC的化学结构相似，但作用机制却不同[11-12]。SRL独特的免疫抑制机制使其不仅具有强大的免疫抑制作用，同时肾毒性小兼具抗肿瘤作用，并具有诱导和维持外周免疫耐受的潜能。国内外大量报道SRL可以选择性扩增Treg，并保持其免疫抑制能力[10-11]。

在肾移植受者中，应用环孢素和TAC会减少肾移植受者体内Treg的数量，阻碍免疫耐受的发生[12-13]，SRL则可以在抑制效应T细胞增殖的同时，不影响Treg的增殖和能力[14]。另外也有不少研究报道SRL能够抑制树突状细胞CD86的表达，使其停留在未成熟状态，影响其抗原呈递能力[15]，延长移植物的生存时间[15-16]。至今，对SRL在诱导免疫耐受方面的猜想仍停留在SRL对Treg和树突细胞(DC)的影响上，还未有SRL会提高肾移植受者长期生存率的报道。此外，研究表明CD19+CD5+CD1d+Breg参与移植后免疫调节，具有诱导和维持外周免疫耐受的作用[17-18]，关于免疫抑制剂对Breg的影响也鲜有报道。本研究旨在探讨临床移植后长期应用SRL与TAC对肾移植受者免疫状态的影响，为此我们检测了受者外周血Treg、Breg以及受者淋巴细胞经供者抗原刺激后的免疫反应能力。

图1 3组外周血CD4+CD25+Foxp3+ Treg流式细胞分析

图2 3组CD19+CD5+CD1d+ Breg流式细胞分析

图3 TAC组、SRL组分泌IFN-γ、IL-10的细胞频数

本研究结果显示，SRL组肾移植受者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+Treg的比例显著高于TAC组(P＜0.05)，与空白对照组比较差异无统计学意义，长期应用TAC会降低Treg的比例，而SRL则对Treg无明显影响；说明目前常规应用的免疫抑制方案无益于免疫耐受的诱导。3组患者外周血CD19+CD5+CD1d+Breg占CD19+B细胞的比例相互之间差异无统计学意义，这说明不管是SRL还是TAC均不影响Breg的数量。

为进一步探讨SRL及TAC对肾移植受者免疫状态的影响，我们应用ELISPOT检测两组受者外周血淋巴细胞经供者特异性淋巴细胞刺激后分泌Th1、Th2的细胞频数。目前认为，Th1细胞主要分泌IFN-γ、IL-2，与细胞排斥反应有关，而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-10，可以抑制Th1细胞的排斥反应，有助于诱导耐受，同时临床上产生耐受的受者体内Th2细胞因子占优势。基于此，我们分别检测了分泌IFN-γ(Th1)、IL-10(Th2)的细胞频数。结果表明，两组受者特异性分泌两种细胞因子的细胞频数差异亦无统计学意义，提示两组受者外周血淋巴细胞对供者特异性刺激后反应性无差异。

总之，长期应用SRL对肾移植受者外周血Treg无明显影响，而TAC则显著减少Treg比例，但两者对CD19+CD5+CD1d+Breg均无影响。两组受者外周血淋巴细胞对其相应供者外周血淋巴细胞特异性刺激后分泌IFN-γ、IL-10的细胞频数无显著差异，推测两种免疫抑制方案对肾移植受者体内免疫状态的影响无显著差异。由于本研究例数有限，需要增加样本量进一步证实此结论。