大鼠原位肾移植模型的建立及技术改进

林淼，王继纳，许明，戎瑞明，朱同玉，(.复旦大学附属中山医院泌尿外科，上海 0003；.上海市器官移植重点实验室，上海 0003)

肾移植是目前尿毒症患者的首选治疗手段。由于临床试验的诸多限制性，因而建立合适的肾移植动物模型对肾移植相关基础及应用研究具有重要的应用价值。大鼠原位肾移植模型是目前国内外进行肾移植相关免疫学研究普遍采用的动物模型[1]。为了建立更加稳定、简便易操作的大鼠肾移植模型，在过去的40多年中，各种技术改进不断地被应用于大鼠肾移植模型的建立中[2-3]。通过不断摸索及技术改进，本中心采用动脉端端吻合、静脉端端吻合和输尿管端端吻合法建立一种稳定、可靠的大鼠肾移植模型，现总结如下。

1 材 料

1.1 实验动物

无特定病原体(SPF)级Wistar雄性大鼠，体重250～300 g，由复旦大学附属中山医院实验动物中心购置并饲养。动物合格证号：SYXK(沪)2013-0039。

1.2 实验器械

显微外科器械(上海医疗器械有限公司手术器械厂，SB0220)，台式手术显微镜(上海医光仪器有限公司，SXP-1C)，常规手术器械(上海医疗器械有限公司手术器械厂)，冲洗针头、血管夹，自制腹腔拉钩，6-0、8-0及11-0带针显微缝线，3-0带针缝合线(上海浦东金环医疗用品有限公司)，动物实验用双极止血电刀(Gemini Cautery System，Stoelting Co.美国)。

1.3 实验药品

1%戊巴比妥钠(德国进口，批号20090512)，肝素钠(上海福达制药有限公司，批号101004)，2%利多卡因(上海第一生化药业有限公司，批号101103)，乳酸钠林格液(上海长征富民金山制药有限公司)，碘伏(上海利康消毒高科技有限公司)，生理盐水(浙江天瑞药业有限公司)，青霉素钠(华北制药股份有限公司)。

2 模型的建立方法

2.1 麻醉

供受鼠均为Wistar大鼠，术前12小时禁食，不禁水，1%戊巴比妥钠10 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠。

2.2 供肾切取

大鼠麻醉后，备皮消毒，仰卧位取腹正中切口，沿腹中线从剑突下至耻骨联合上剪开皮肤及肌肉进入腹腔，勿伤及肠道。自制腹腔拉钩牵开腹腔，湿棉签向右侧推开肠道，显微剪游离脾结肠韧带，将左侧肠道推至右侧腹腔切口外，以生理盐水湿纱布包裹。

打开后腹膜，滴注2%的利多卡因约1 ml于血管，保持血管湿润的同时还可以减轻血管游离过程中的痉挛现象。湿棉签推开腹主动脉与下腔静脉表面脂肪组织，自腹主动脉分叉处向上充分游离腹主动脉及下腔静脉至左肾动脉以上水平。显微镊游离输尿管，注意保留伴行血管，游离至肾下极2 cm处斜行剪断输尿管。游离肾脏至近肾门处，保留少量肾周脂肪组织以便牵拉肾脏。自近端向远端游离肾动脉及肾静脉至近肾门，8-0显微缝线结扎肾静脉分支，如性腺血管、肾上腺动静脉。处理肾动静脉时，仔细操作，注意变异小分支的存在，并同样分离结扎或电刀电灼止血。

肾动脉、肾静脉、下腔静脉及腹主动脉游离充分后，取1 ml肝素生理盐水(100 U/ml)于阴茎背静脉注射，全身肝素化受鼠。于左肾动脉与右肾动脉间腹主动脉下方穿过6-0丝线一根，打好空的外科结、暂不收紧。腹主动脉分叉处上方以同样的方法置空结线一根，并以血管夹于此线下方阻断腹主动脉，收紧最上方的外科结，紧贴下腔静脉剪断左肾静脉。于血管夹阻断水平以上的腹主动脉以28G留置针穿刺，收紧预置的6-0空结线，固定针头。缓慢匀速注入4℃肝素生理盐水，可见肾静脉端口流出血性液体，持续注入灌注液至静脉端流出液为无色，肾脏颜色苍白为止，总量约5 ml。近腹主动脉离断肾动脉，取下肾脏，放入已预置冰上的肝素生理盐水中。

2.3 供肾移植

同供鼠操作，暴露受鼠游离肾脏，结扎肾上腺、性腺血管等分支，游离左肾动脉、肾静脉，于肾门下约1 cm处结扎并斜行剪断输尿管。近腹主动脉及下腔静脉，以动脉夹阻断肾动脉、肾静脉，近肾门剪断肾动、静脉，移除受体左肾。用肝素生理盐水冲洗近端残端，尽量冲出残留血液，修剪断面。

用纱布自制带洞肾袋，置入供肾，使肾动脉、静脉和输尿管经洞口暴露于肾袋外，肾袋表面撒少量冰水，以保持肾脏低温。首先吻合位于背面的肾动脉，采用11-0带针缝线两定点法行间断吻合。首先于肾动脉上方和下方缝合两针，分别用血管夹固定作牵引。先缝合前壁，在前壁正中缝合一针，暂不打结。在中点针与上、下定点的中点处各缝合一针，均暂不打结，待3针均结束以后依次打结。翻转固定线，使后壁朝前，同法缝合后壁，完成后剪断固定线，动脉共计吻合8针(含两定点)。肾静脉也采用两定点法，11-0带针缝线连续缝合。先缝合后壁，缝完后壁后与相连固定线打结，无需翻转固定线，继续缝合前壁。前后壁各缝合7针左右，缝合完成后剪断固定线。

经阴茎背静脉注入含80 kU青霉素钠的温生理盐水约3 ml补充血容量，使用血管夹分别阻断吻合口远端的肾动脉及肾静脉，开放吻合口近端血管夹，观察血管通畅与否，是否有明显渗漏。一般而言，开放血管后初期可见吻合口少量渗血，采用棉签轻轻压迫1分钟后即可止血。如出血明显难以止住，则可谨慎进行补缝。血管吻合通畅后剪开肾袋，开放肾门处血管夹，观察肾脏灌注后颜色与质地，输尿管口有无尿液流出。如吻合口通畅，30秒内可见肾脏迅速变红，质地变硬，动脉搏动良好，静脉充盈。

继续观察输尿管口5分钟左右，见尿液流出后行输尿管端端吻合。采用11-0带针缝合线，斜行贴合两输尿管残端，分别于4点间断缝合输尿管。最后切除右侧肾脏，检查腹腔有无活动性出血，温生理盐水冲洗腹腔，以利于受鼠复温。使用3-0带针缝合线缝合肌肉、皮肤，手术结束。

2.4 术后处理

麻醉苏醒前将大鼠置于实验动物用保温毯上复温，麻醉复苏后即可恢复饮食，注意保持干燥、保暖，每只受鼠单独置一笼，继续饲养于本院SPF级实验动物中心。

3 结 果

对已完成的10对大鼠移植时间进行统计，完成1对大鼠肾移植需要(211.00±13.24)分钟，其中供肾切取手术时间为(87.00±5.34)分钟，供肾移植手术时间为(120.00±7.90)分钟；供肾移植中原肾脏切除(27.00±1.12)分钟，动脉吻合(35.00±1.98)分钟，静脉吻合(36.00±3.26)分钟，输尿管吻合(22.00±1.54)分钟。供肾热缺血时间为30秒，肾脏冷缺血时间约为100分钟。

一般认为，大鼠失去双侧肾脏24小时内将死亡，因此，我们选择术后3天为界限，判断肾移植是否成功。在实验技术成熟后，我们进行了10对大鼠原位肾移植，其中8对大鼠存活时间大于3天，移植肾均稍增大，形态、功能良好，其余2对大鼠死亡原因包括吻合口出血、血栓形成、尿漏等。

缝合完成后，可见动脉搏动良好，吻合口通畅，肾静脉饱满，回流通畅(图1)，动脉位于背面不可见。吻合口附近稍有渗血，已止住。解剖术后3天仍存活的大鼠，可见移植肾形态良好(图2)，体积稍有增大，大体形态未见异常。

图1 大鼠左侧肾脏移植模型，血管开放后

图2 左侧肾脏移植术后3天大鼠移植区探查

4 讨 论

目前在国际上，大鼠肾移植模型的建立方法已经比较多样化，其中包括肾动脉及肾静脉的端端和端侧吻合，输尿管的端端和带膀胱瓣吻合，以及类似于肝移植的支架吻合法等[4-5]。但这些方法均不符合肾脏原有解剖位置，且各有不足之处：如血管端侧吻合易出现术后出血等并发症，且灌注压相对不足，术中阻断腹主动脉及下腔静脉容易导致其他器官的缺血性损伤及血栓形成；套管法仅适用于静脉，需自制套管，且由于不同大鼠血管条件不同，利用多有限制；输尿管带膀胱瓣吻合对受鼠损伤较大，由于供肾输尿管游离路径较长，易导致输尿管血管损伤，进而引起术后缺血性坏死。故本文采用了肾血管及输尿管端端吻合，这是最符合肾脏生理解剖的方法[6-7]。

手术操作首先涉及视野的暴露，作者采用了大回形针自制拉钩，前方为三角形拉钩，后方为折弯锐头。此种拉钩可自行控制拉钩大小、角度和长度，用于手术视野暴露十分方便。采用左、右和上方三个拉钩暴露，可较好显露操作视野。

如何安全充分地游离腹主动脉、下腔静脉及肾动脉、肾静脉，是手术成功重要环节。大鼠静脉壁较薄，游离时易撕裂出血。为此作者采用了弯头眼科镊，探入背侧后从动静脉之间进行分离，同时可使用显微镊从腹侧协助操作。该游离方法特别适用于腹主动脉与下腔静脉间的分离，十分简单易行、安全可靠。

术中止血是本手术成功的另一重要环节。大鼠血管较细，除腹主动脉、下腔静脉、肾动静脉等大血管以外，大部分血管的出血均通过压迫即可止住。出血位置明确处可用电刀电灼止血，或者用棉签压迫止血；如出血位置较隐蔽或较深，难以触及，可使用显微镊钳夹，以电刀电灼显微镊尖端止血。

充分的供肾灌注是保持移植肾功能的必要条件。行肾脏灌注前，首先要做好血管准备。分离肾动静脉根部粘连处，弯头眼科镊从动静脉上方插入，往下方分离，可安全便捷地从根部开始分离肾动静脉。分离完成后，于相应位置的腹主动脉下方穿过6-0丝线一根，打好空的外科结、暂不收紧，相较于利用血管夹阻断可减少热缺血时间。冲洗过程应保持流速的稳定、均一，一般冲入5 ml液体即可，具体冲洗量以冲洗至流出液清澈为止。

肾动静脉吻合完成后，在开放前需要经阴茎背静脉注入含80 kU青霉素钠的温生理盐水约3 ml。补液一方面是为了补充手术中丢失的体液，如出血、非显性蒸发等；另一方面是为了预防术后感染，青霉素钠属于易于得到而且效果良好的抗菌药物[2]。

输尿管缝合一直是大鼠肾移植的一个难点。作者采用了输尿管端端4针吻合法。在外科显微镜下看见两断端输尿管开口后，使用带线双头针，分别由管腔内向管腔外缝合，出针后先不打结，待4针均完成后一次性打结，以避免打结后导致输尿管口不可见，影响后续缝合。

另外，相比于SD大鼠，Wistar大鼠肾动静脉上方动静脉分支极多，且常有变异，在脂肪组织覆盖下，无论是钝性分离还是锐性分离均极易出血。这些血管多为肾动静脉发出，出血后极难止血。因此，为了安全便捷地结扎包括肾上腺动静脉在内的这些分支血管，作者先从肾脏上极处开始游离脂肪组织至后腹膜，在视野内小心分离至肾动静脉上方，而后在肾上腺动静脉根部两侧亦小心分离脂肪组织至后腹膜。到目前为止，肾动静脉上方总共有两堆包含血管的脂肪组织，采用8-0线分别牢固结扎后剪断。采用该法处理肾血管上方分支十分安全，且操作简单，可大幅缩短分离时间。

采用改进后的上述操作方法，短期练习后即可安全、便捷地建立成熟、稳定的大鼠原位肾移植模型。从前期的实验结果可见，本方法所建立的肾移植模型中受鼠存活率较高，术后手术相关并发症较少，移植肾功能良好。