西藏牦牛大肠杆菌对常用抗菌药物的耐药性分析

贡 嘎，王 刚，拉 珍，邢东义，索朗斯珠

（西藏大学农牧学院动物科学学院，西藏 林芝 860000）

大肠杆菌是人和动物的肠道共栖菌和条件性致病菌。由于畜禽养殖期间大量、广泛使用抗菌药物，造成动物源大肠杆菌耐药株不断增多，耐药机制日趋复杂[1]，给动物疾病防治带来严峻挑战；目前，细菌对常用抗生素产生耐药性已经引起普遍的关注，其中大肠杆菌的耐药性研究较为集中也较为深入[2]。大肠杆菌耐药株引起的感染在临床上不但有增多趋势，而且其耐药性亦不断发生变迁[3]。而区牦牛大肠杆菌耐药性的研究报道较少，本文从本区不同地区分离鉴定牦牛大肠杆菌，并对牦牛大肠杆菌耐药性进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料 在拉萨当雄、林芝、日喀则、阿里、那曲、昌都等地采集腹泻牦牛新鲜无污染粪便，装入自封袋，编号，待检。

1.2 主要试剂 （1）普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板、伊红美蓝平板、生化培养基均由本实验室制备[4]；（2）药敏纸片：共15种，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 细菌的分离与鉴定

1.3.1 分离培养 无菌取出待检粪样，接种在普通平板上，在37℃培养24 h，观察生长情况，并进行革兰染色镜检。

1.3.2 鉴定 挑取普通平板上典型菌落分别接种在麦康凯琼脂平板及伊红美蓝平板上划线，37℃培养24 h，观察结果。同时挑取典型菌落分别接种到生化培养基，37℃培养，每天观察结果。

1.4 药敏试验 无菌操作选取分离细菌纯培养物致密划线于普通营养琼脂平板上，将临床常用的15种抗生素药敏纸片贴于琼脂平板表面中央处，倒置平皿，放于37℃培养箱中培养24 h后观察结果。

1.5 抑菌结果的判定 参照NCCLS（2013）公布的标准以敏感（Susceptible）、中介（Intermediate）、耐药（Resistant）3种形式对抑菌圈大小作出判定，个别抑菌圈大小参考相关文献作出判定，具体判定标准见表1。

表1 药敏试验判定标准

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌分离鉴定

2.1.1 在普通平板上生长出圆形、光滑、湿润、半透明、灰白色菌落。经革兰染色后发现革兰阴性两端钝圆的直杆菌。

2.1.2 在麦康凯琼脂平板及伊红美蓝平板上分别形成红色菌落和带金属闪光的菌落。并能发酵乳糖、葡萄糖、蔗糖，其中乳糖发酵最快。甘露醇、吲哚、甲基红均阳性，V-P、枸橼酸、氧化酶呈阴性。

2.2 大肠杆菌体外药敏试验结果 药敏试验选用分属6类抗菌药物的15种抗菌药物，其中β-内酰胺类3种，氨基糖苷类5种，四环素类2种，喹诺酮类3种，酰胺醇类1种，其他1种。药敏试验表明，西藏牦牛耐药大肠杆菌对同类药物之间存在交又耐药性。见表1。

2.3 牦牛耐药大肠杆菌的耐药率

2.3.1 西藏牦牛大肠杆菌的耐药情况 来自西藏拉萨当雄、林芝、日喀则、阿里、那曲、昌都等地11个牦牛耐药大肠杆菌对15种抗菌药物有不同程度耐药性。见表2，图1。

表2 药物敏感试验结果

2.3.2 11株耐药菌株的耐药谱 11株牦牛耐药大肠杆菌对15种抗菌药物有不同程度的耐药性，且多重耐药现象较重（表3），最少为7种，最多为12种。8耐和11耐菌株所占总菌株比例最大为27.27%；其次是 9耐为18.18%；7耐、10耐、12耐菌株均占总菌株的9.09%。见图2。

表3 牛源耐药大肠杆菌的多重耐药率

3 讨论

3.1 牦牛大肠杆菌的耐药现状及分析 已有研究表明,我国多重耐药现象普遍严重[5]。本试验结果表明，西藏牦牛肠道大肠杆菌对抗菌药物的耐药率极高，作者认为，由于西藏老百姓文化水平较低，目前对细菌耐药性的认识不够清楚，因此在食品动物养殖中普遍存在滥用抗生素以及严重缺乏联合、交叉、轮换等用药方式来减少细菌的耐药率的意识。因此西藏牦牛大肠杆菌耐药水平较高、耐药谱较广，多重耐药现象较重。

大肠杆菌作为肠道菌，在条件变差及其他病原感染后易继发致病。并且其血清型众多，抗原复杂，变异大，菌株易产生广泛的耐药性和多重耐药性，在实际生产中疫苗预防和药物防治效果不理想。本试验采用WHO推荐的K-B纸片法检测11株大肠杆菌对15种抗菌药物的敏感性。其中对头孢唑啉、氨苄西林、多西环素、头孢氨苄、呋喃妥因、新霉素的耐药率较高，其中对头孢唑啉耐药率为100%，对后5种药的耐药率也高达90.9%，对四环素和链霉素的耐药率达81.8%，对阿米卡星、阿莫西林和庆大霉素的耐药率分别为72.7%和63.4%、对卡那霉素耐药程度较低，达36.3%。；但耐药菌株对氧氟沙星、氟罗沙星、诺氟沙星等药物的敏感性较高，达90.9%～100%。

试验结果表明，兽医临床用药应根据药敏试验结果，有针对性地使用，而且必须经常更换抗菌药种类，以免产生新的耐药菌株，同时较好地控制畜禽大肠杆菌病，只有这样才能有针对性的选用敏感药物。另一方面，尽量在饲料中少用抗菌药，治疗用药必须合理，有针对性，在食品动物养殖中少并再不可滥用抗菌药，还应考虑采取联合用药、交叉或轮换用药等方法[7]。

试验结果表明，本次从西藏牦牛体内分离的大肠杆菌对头孢唑啉、氨苄西林、多西环素、头孢氨苄、呋喃妥因、新霉素的耐药率较高，表明只有少数药物对多数分离菌株有效，多数药物的效力不理想，大量耐药菌株的产生，已给当地养牛业造成了巨大的经济损失。所以对病原菌进行耐药性检测势在必行。因此建议在兽医临床上应选停用耐药性极强的药物，应选择敏感性较高的药物来针对性治疗牦牛大肠杆菌病。

3.2 控制牦牛大肠杆菌耐药性的对策 （1）大力宣传细菌耐药性等相关专业知识，提高老百姓对细菌耐药性的意识，做到家喻户晓，人人皆知；（2）实行管理部门与兽医人员的指导下计划性轮换、交叉或联合用药；（3）使用抗生素的同时，开发及利用传统藏兽药对降低细菌耐药可能具有重要的意义；（4）治疗用药应根据药敏试验结果，用药必须合理、有针对性；而且必须经常更换抗菌药种类，以免产生新的耐药菌株；（5）应以免疫预防为主，执行严格的消毒隔离制度，同时动物加强饲养管理。

[1]马红霞，刘玉堂，伞治豪.不同动物源性大肠杆菌多重耐药调控基因rob的同源性分析[J].中国兽医科学，2007，37（12）:1035-1040.

[2]俞道进，黄一帆，邓文华，等.猪场大肠杆菌耐药性的流行病学调查[J].福建农林大学学报（自然科学版），2005，34（9）：357-360.

[3]Murray B E.New aspects of antimicrobial resistance and resulting the therapeutic dilemmas[J].J Infect Dis，1991，163:1185.

[4]姚火春.兽医微生物学实验指导[M].北京：中国农业出版社，2011：36-42.

[5]吕殿红，曾振灵，陈杖榴，等.大肠埃希菌多重耐药性的形成机制[J].动物医学进展，2007，28（7）:76-81.